【摘要】：建立了菊酯類農(nóng)藥廣譜型免疫層析檢測方法,可同時檢測水果、蔬菜中12種甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯農(nóng)藥殘留。以粒徑20 nm的膠體金標記羊抗小鼠IgG抗體于金標墊上,分別固定包被原(檢測線,T線)、兔抗山羊IgG抗體(質(zhì)控線,C線)于硝酸纖維素膜(NC膜)上,與吸水墊及聚氯乙烯(PVC)底板組合成層析試紙條。10 g樣品經(jīng)乙腈提取,PBS稀釋4倍,取100μL與菊酯類農(nóng)藥的單克隆抗體混合后,直接用于試紙條檢測。結(jié)果表明,試紙條對甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯農(nóng)藥的裸眼觀察檢測靈敏度為0.5,5.0,5.0和5.0μg/mL,檢測時長為8~10 min,采用QuEChERS方法,方法檢測靈敏度可提高16倍。對蔬菜和水果的方法驗證表明,除辣椒基質(zhì)干擾呈假陽性外,其它樣本的檢測結(jié)果均與GC方法結(jié)果一致。試紙條采用金標羊抗小鼠IgG二抗的方法,使檢測結(jié)果的重現(xiàn)性更好、更穩(wěn)定,且抗基質(zhì)干擾能力強,為菊酯類農(nóng)藥的累積毒性檢測提供了新方法。
【圖文】：

圖1膠體金免疫層析試紙條的組裝示意圖(1．PVC底板，2．NC膜，3．金標結(jié)合墊，4．吸水墊，5．檢測線(T線)，6．質(zhì)控線(C線)，7．樣品墊)Fig．1Cross-sectionofimmunochromatographicstrip(1．polyvinylchloride(PVC)backing，2．nitrocellulose(NC)membrane，3．conjugatepad，4．a(chǎn)bsorbentpad，5．testline，6．controlline，7．samplepad)抗體形成的復合物在T線上沉積，形成肉眼可見的紅色，過量的金標二抗及其與單克隆抗體形成的復合物繼續(xù)向上遷移，與C線上的兔抗山羊抗體結(jié)合，形成肉眼可見的紅色。當檢測線顏色等于或深于質(zhì)控線，結(jié)果判斷為陰性。(2)當待檢樣品含有大于或等于該試紙最低檢出限的菊酯農(nóng)藥時，樣品液中農(nóng)藥與單克隆抗體特異性結(jié)合，阻止了其與T線上包被原的結(jié)合，使得單克隆抗體與金標羊抗鼠二抗形成的復合物無法在T線上形成沉淀，樣品中菊酯含量越高，檢測線顏色越淺至無色，膠體金標記的抗體及其復合物繼續(xù)向上遷移到質(zhì)控線，與C線上的兔抗山羊抗體結(jié)合，形成肉眼可見的紅色。此時T線顏色變淡(淺于C線顏色)或接近無色，結(jié)果判斷為陽性。(3)當C線沒有顏色時，無論T線是否有圖2免疫層析試紙條檢測結(jié)果判定示意圖Fig．2Schematicdiagramofimmunochromatographicstripstest顏色，均視為無效結(jié)果。檢測時長8～10min，結(jié)果判斷如圖2所示。2．4樣品提取與前處理2．4．1有機溶劑選擇取10g切碎的蔬菜、水果樣品(洋蔥、蔥、生姜、大蒜、韭菜、小青菜、辣椒、胡蘿卜、番茄、黃瓜、蘋果、西瓜、大白菜)到50mL玻璃瓶中，加入標樣使添加濃度分別為0，2和4μg/mg(每個濃度做3個重復)，靜置30min后，加入10mL甲醇/乙腈/丙酮/20%甲醇-PBS溶液，振蕩30min，過濾，取1mL濾液用PBS溶液稀釋4倍，用于試紙條檢測。另取1mL濾液，氮氣吹干后，以

蚩固褰岷希嚯緯扇庋劭杉鉨暮焐郶５奔觳庀哐丈鄏扔諢蟶鈑?質(zhì)控線，結(jié)果判斷為陰性。(2)當待檢樣品含有大于或等于該試紙最低檢出限的菊酯農(nóng)藥時，樣品液中農(nóng)藥與單克隆抗體特異性結(jié)合，阻止了其與T線上包被原的結(jié)合，使得單克隆抗體與金標羊抗鼠二抗形成的復合物無法在T線上形成沉淀，樣品中菊酯含量越高，檢測線顏色越淺至無色，膠體金標記的抗體及其復合物繼續(xù)向上遷移到質(zhì)控線，與C線上的兔抗山羊抗體結(jié)合，形成肉眼可見的紅色。此時T線顏色變淡(淺于C線顏色)或接近無色，結(jié)果判斷為陽性。(3)當C線沒有顏色時，無論T線是否有圖2免疫層析試紙條檢測結(jié)果判定示意圖Fig．2Schematicdiagramofimmunochromatographicstripstest顏色，均視為無效結(jié)果。檢測時長8～10min，結(jié)果判斷如圖2所示。2．4樣品提取與前處理2．4．1有機溶劑選擇取10g切碎的蔬菜、水果樣品(洋蔥、蔥、生姜、大蒜、韭菜、小青菜、辣椒、胡蘿卜、番茄、黃瓜、蘋果、西瓜、大白菜)到50mL玻璃瓶中，加入標樣使添加濃度分別為0，2和4μg/mg(每個濃度做3個重復)，靜置30min后，加入10mL甲醇/乙腈/丙酮/20%甲醇-PBS溶液，振蕩30min，過濾，取1mL濾液用PBS溶液稀釋4倍，用于試紙條檢測。另取1mL濾液，氮氣吹干后，以正己烷定容，用于GC檢測［23］。2．4．2簡化QuEChEＲS方法［24］取5g切碎樣品至50mL離心管中，加入5mL乙腈渦旋震振蕩提取3min后，4000r/min離心5min，取上清液2mL于40℃水浴氮氣吹干，用20%甲醇-PBS溶液0．5mL復溶提取物，用于試紙條檢測。3結(jié)果與分析3．1膠體金和膠體金標記抗體掃描圖譜用紫外分光光度計對所制備的膠體金進行波長掃描，從圖3a可見，膠體金溶液的最大吸收波長λmax=520nm，吸光度為0．9556;透射電鏡觀察膠體金顆粒，粒徑均一性較?

圖3膠體金溶液掃描圖譜(a)，膠體金的透射電鏡圖(b)Fig．3Visiblespectrumofcolloidalgold(a)，TEMimageofcolloidalgold(b)4μL時，離心管內(nèi)顏色呈紅色，隨著抗體量加大，管內(nèi)顏色未有明顯變化，因此，羊抗小鼠二抗的最小標記濃度為4μg/mL。根據(jù)最小標記濃度，選擇3．5，4．0，4．5，5，5．5和6．0μg/mL標記濃度對膠體金進行標記，將T線上出現(xiàn)肉眼可見的且顏色較紅的標記濃度確認為抗體的最佳標記濃度。當抗體標記濃度＜4μg/mL時，T線顏色較淺;抗體標記濃度為5μg/mL時，T線顏色出現(xiàn)較為明顯的紅色條帶。因此，5μg/mL作為抗體最佳標記量。3．3菊酯類農(nóng)藥單克隆抗體加入量優(yōu)化分別在100μL20%甲醇-PBS的緩沖液中加入0．3，0．5，0．8，1．0和1．5μL的菊酯類農(nóng)藥單克隆抗體(1．0mg/mL)，10min后觀察T線顏色深淺。當單加入0．3μL克隆抗體時，T線顏色較淺;加入0．5μL克隆抗體時，T線顯色清晰;隨著單克隆抗體濃度量的加大及時間的延長，T線顏色逐漸加深。所以，0．5μL為最佳單克隆抗體量。3．4免疫層析試紙條的檢出限用20%甲醇-PBS配制系列梯度農(nóng)藥標準品，濃度為0，0．1，0．2，0．5和1．0μg/mL甲氰菊酯標準溶液，濃度為0，0．2，0．5，1．0，5，10和20μg/mL的氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯標準品溶液。分別取100μL，與適量的菊酯單克隆抗體預混后加入上樣孔，10min后觀察結(jié)果。隨著菊酯農(nóng)藥濃度升高，T線區(qū)域紅色逐漸變淺，C線區(qū)域紅色無明顯變化，在甲氰菊酯標準溶液濃度為0．5μg/mL時T線基本消失(圖4)，氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯在濃度為5μg/mL時，試紙條T線基本消失(圖5)。甲氰菊酯試紙條的檢出限為0．5μg/mL，可滿足國家標準中對應水果、蔬菜中農(nóng)藥最大殘留限量的要求(0．5～5．0mg/kg，GB2763-2014)，氯氰菊酯、三氟氯氰菊

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