【摘要】：本研究將磁性納米顆粒與分子印跡技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)一種蛋白質(zhì)快速高效分離純化新方法,為復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)的快速高效分離純化提供一種新思路。本研究制備了硅氧基(O-Si-O)和羧基(-COOH)等基團(tuán)修飾的磁納米顆粒Fe_3O_4@SiO_2-AA,以牛血紅蛋白(bovine hemoglobin,BHb)作為模板在磁顆粒上進(jìn)行分子印跡反應(yīng),成功制備了分子印跡磁性納米顆粒(magnetic molecularly imprinted nanoparticles,MIP),對(duì)MIP進(jìn)行表征,并對(duì)其對(duì)蛋白質(zhì)的吸附分離和洗脫性質(zhì)進(jìn)行了研究,具體研究內(nèi)容如下:首先,利用化學(xué)沉淀法制備Fe_3O_4納米顆粒,對(duì)Fe_3O_4納米顆粒進(jìn)行O-Si-O和-COOH等基團(tuán)的修飾得到Fe_3O_4@SiO_2-AA顆粒。選擇甲基丙烯酸(methylacrylic acid,MAA)和衣康酸(itaconic acid,IA)作為功能單體,N’N-亞甲基雙丙烯酰胺(N’N-methylene bis acrylamide,N’N-MBA)作為交聯(lián)劑,利用分子印跡技術(shù)制備MIP顆粒。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用0.3%Fe_3O_4@SiO_2-AA顆粒,0.35%甲基丙烯酸,0.125%衣康酸和0.08%的N’N-MBA進(jìn)行分子印跡時(shí),所得到的MIP顆粒具有最優(yōu)的BHb分子吸附量。其次,對(duì)所得磁顆粒進(jìn)行了表征。利用傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)O-Si-O和-COOH基團(tuán)以及分子印跡聚合層成功地修飾在磁顆粒表面。透射電子顯微鏡表征發(fā)現(xiàn)MIP顆粒的粒徑大致在20 nm左右,具有良好的分散性。通過熱重分析發(fā)現(xiàn)MIP顆粒的磁含量約為84%,分子印跡層穩(wěn)定性好。元素分析結(jié)果顯示MIP的C含量為4.06%,MIP顆粒中模板蛋白BHb分子已完全洗脫。Zeta電位分析顯示MIP的等電點(diǎn)為pH 4.5左右,也說明了所需基團(tuán)和分子印跡聚合物的成功修飾。再次,本論文研究了不同環(huán)境條件對(duì)MIP吸附BHb過程的影響,并探究了其吸附機(jī)理。吸附動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)吸附12 h時(shí),MIP顆粒對(duì)BHb的吸附達(dá)到平衡,獲得了最大吸附量116.69 mg/g顆粒,吸附過程符合擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。等溫吸附研究得出吸附過程中BHb的最佳初始濃度為1.0 mg/m L,并且吸附過程符合Langmuir等溫吸附模型描述的單分子層吸附。由不同溶液條件下MIP顆粒對(duì)BHb吸附量的研究可知,在pH 6.2時(shí),由于靜電吸引作用,MIP顆粒的吸附量可以達(dá)到169.29 mg/g顆粒。在NaCl濃度較低時(shí),由于低濃度鹽溶液對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用,MIP顆粒對(duì)BHb的吸附量較大,而在高濃度NaCl溶液中,由于電荷屏蔽及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,MIP顆粒對(duì)BHb的吸附受到抑制。在不同濃度尿素溶液中的吸附結(jié)果顯示,MIP顆粒與BHb之間的氫鍵作用對(duì)其吸附效果具有一定程度的貢獻(xiàn)。在SDS(sodium dodecyl sulfate)溶液和高濃度的尿素溶液中,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變使MIP對(duì)其吸附作用大大減弱。由MIP對(duì)BHb的選擇性和競(jìng)爭性吸附可以發(fā)現(xiàn),MIP顆粒僅對(duì)模板蛋白有特異性的吸附作用,對(duì)其他蛋白質(zhì)的吸附作用較弱。此外,本論文研究了不同洗脫液對(duì)MIP顆粒上BHb的洗脫效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)去離子水對(duì)BHb具有較高的洗脫率(64.23%),而以不同濃度NaCl溶液、不同pH值的PBS溶液、不同濃度的尿素溶液作為洗脫液對(duì)BHb的洗脫率均小于去離子水。用SDS溶液作為洗脫液結(jié)果顯示,當(dāng)SDS的濃度達(dá)到1%以上時(shí),其對(duì)MIP顆粒上BHb分子的洗脫率十分接近100%。對(duì)不同洗脫液的洗脫得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析得,去離子水、NaCl洗脫液、PBS洗脫液洗脫得到的BHb分子結(jié)構(gòu)保持良好,不易發(fā)生變性,而高濃度的尿素溶液以及SDS溶液洗脫得到的BHb結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。最后,在經(jīng)過5次重復(fù)吸附洗脫實(shí)驗(yàn)后,MIP顆粒對(duì)BHb分子的吸附量仍可以達(dá)到110 mg/g以上,顆粒具有良好的材料穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ936;O631.3
【圖文】：

具有固定三維結(jié)構(gòu)和確定排列功能團(tuán)的空穴，并且這些空穴與模板60]。根據(jù)模板分子與功能單體之間的作用力種類可以將 MIT 分為印跡、半共價(jià)分子印跡、非共價(jià)分子印跡以及金屬絡(luò)合分子印跡。預(yù)定性、特異識(shí)別性和廣泛實(shí)用性等三大特點(diǎn)，使得 MIT 逐漸成學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、工業(yè)催化等領(lǐng)域交叉的新興技術(shù)。MIT 已經(jīng)在、模擬酶以及生物傳感器等方面顯示出巨大的應(yīng)用前景[61]。印跡技術(shù)包含了三個(gè)主要環(huán)節(jié)，如圖 1-1 所示：選擇目標(biāo)分子作為分子印跡的模板分子，選取合適的一種或多種須含有可以與模板分子適配結(jié)合的功能基團(tuán)，選取可以結(jié)合功能單交聯(lián)劑，選擇合適的引發(fā)劑用于引發(fā)聚合反應(yīng)。將模板分子與功能單體混合使其通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵結(jié)合進(jìn)行劑和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)，形成呈網(wǎng)絡(luò)狀的分子印跡聚合物。使用合適的洗脫液將模板分子從分子印跡聚合物上洗脫下來，在成具有一定大小、形狀和特定功能基團(tuán)排列的孔穴，用于后續(xù)對(duì)�；蛭絒62, 63]。

3 結(jié)果與討論3.1 分子印跡磁性納米顆粒的制備MIP 的制備過程如圖 3-1 所示。采用化學(xué)共沉淀法在高轉(zhuǎn)速攪拌下制備出的 Fe3O4磁性納米顆粒具有粒徑小、比表面積大等特點(diǎn)，然而，由于其具有極強(qiáng)的超順磁性，彼此之間極易聚集。加入 TEOS 為磁顆粒表面引入 O-Si-O 基團(tuán)，保護(hù)了 Fe3O4顆粒，使其彼此之間不易團(tuán)聚，同時(shí)，避免了 Fe3O4顆粒表面被氧化。丙烯酸（AA）的加入，制備得到了 Fe3O4@SiO2-AA 顆粒，為 Fe3O4磁顆粒表面引入乙烯基和羧基，增加了磁顆粒表面的活性基團(tuán)，為后續(xù)反應(yīng)提供了結(jié)合位點(diǎn)[103]。加入 BHb 進(jìn)行預(yù)組裝時(shí)，BHb 表面的-OH、-COOH 和-NH2等活性基團(tuán)與 Fe3O4@SiO2-AA 顆粒表面的-OH 和-COOH 形成氫鍵結(jié)合，暫時(shí)固定于顆粒表面。而功能單體甲基丙烯酸和衣康酸以及交聯(lián)劑 N’N-MBA的加入，與 Fe3O4@SiO2-AA 顆粒表面的不飽和基團(tuán)發(fā)生聚合反應(yīng)，在磁顆粒表面形成了分子印跡聚合層。用洗脫液將聚合層中的 BHb 洗脫干凈后，分子印跡聚合顆粒表面便得到了許多三維形狀、大小以及功能基團(tuán)均與模板蛋白 BHb 相匹配的孔穴。

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本文編號(hào)：2727425