【摘要】：本研究將磁性納米顆粒與分子印跡技術相結合,開發(fā)一種蛋白質(zhì)快速高效分離純化新方法,為復雜體系中蛋白質(zhì)的快速高效分離純化提供一種新思路。本研究制備了硅氧基(O-Si-O)和羧基(-COOH)等基團修飾的磁納米顆粒Fe_3O_4@SiO_2-AA,以牛血紅蛋白(bovine hemoglobin,BHb)作為模板在磁顆粒上進行分子印跡反應,成功制備了分子印跡磁性納米顆粒(magnetic molecularly imprinted nanoparticles,MIP),對MIP進行表征,并對其對蛋白質(zhì)的吸附分離和洗脫性質(zhì)進行了研究,具體研究內(nèi)容如下:首先,利用化學沉淀法制備Fe_3O_4納米顆粒,對Fe_3O_4納米顆粒進行O-Si-O和-COOH等基團的修飾得到Fe_3O_4@SiO_2-AA顆粒。選擇甲基丙烯酸(methylacrylic acid,MAA)和衣康酸(itaconic acid,IA)作為功能單體,N’N-亞甲基雙丙烯酰胺(N’N-methylene bis acrylamide,N’N-MBA)作為交聯(lián)劑,利用分子印跡技術制備MIP顆粒。研究發(fā)現(xiàn)當采用0.3%Fe_3O_4@SiO_2-AA顆粒,0.35%甲基丙烯酸,0.125%衣康酸和0.08%的N’N-MBA進行分子印跡時,所得到的MIP顆粒具有最優(yōu)的BHb分子吸附量。其次,對所得磁顆粒進行了表征。利用傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)O-Si-O和-COOH基團以及分子印跡聚合層成功地修飾在磁顆粒表面。透射電子顯微鏡表征發(fā)現(xiàn)MIP顆粒的粒徑大致在20 nm左右,具有良好的分散性。通過熱重分析發(fā)現(xiàn)MIP顆粒的磁含量約為84%,分子印跡層穩(wěn)定性好。元素分析結果顯示MIP的C含量為4.06%,MIP顆粒中模板蛋白BHb分子已完全洗脫。Zeta電位分析顯示MIP的等電點為pH 4.5左右,也說明了所需基團和分子印跡聚合物的成功修飾。再次,本論文研究了不同環(huán)境條件對MIP吸附BHb過程的影響,并探究了其吸附機理。吸附動力學研究發(fā)現(xiàn)吸附12 h時,MIP顆粒對BHb的吸附達到平衡,獲得了最大吸附量116.69 mg/g顆粒,吸附過程符合擬二級動力學模型。等溫吸附研究得出吸附過程中BHb的最佳初始濃度為1.0 mg/m L,并且吸附過程符合Langmuir等溫吸附模型描述的單分子層吸附。由不同溶液條件下MIP顆粒對BHb吸附量的研究可知,在pH 6.2時,由于靜電吸引作用,MIP顆粒的吸附量可以達到169.29 mg/g顆粒。在NaCl濃度較低時,由于低濃度鹽溶液對蛋白質(zhì)的結構穩(wěn)定作用,MIP顆粒對BHb的吸附量較大,而在高濃度NaCl溶液中,由于電荷屏蔽及蛋白質(zhì)結構的變化,MIP顆粒對BHb的吸附受到抑制。在不同濃度尿素溶液中的吸附結果顯示,MIP顆粒與BHb之間的氫鍵作用對其吸附效果具有一定程度的貢獻。在SDS(sodium dodecyl sulfate)溶液和高濃度的尿素溶液中,蛋白質(zhì)空間結構的改變使MIP對其吸附作用大大減弱。由MIP對BHb的選擇性和競爭性吸附可以發(fā)現(xiàn),MIP顆粒僅對模板蛋白有特異性的吸附作用,對其他蛋白質(zhì)的吸附作用較弱。此外,本論文研究了不同洗脫液對MIP顆粒上BHb的洗脫效果,結果發(fā)現(xiàn)去離子水對BHb具有較高的洗脫率(64.23%),而以不同濃度NaCl溶液、不同pH值的PBS溶液、不同濃度的尿素溶液作為洗脫液對BHb的洗脫率均小于去離子水。用SDS溶液作為洗脫液結果顯示,當SDS的濃度達到1%以上時,其對MIP顆粒上BHb分子的洗脫率十分接近100%。對不同洗脫液的洗脫得到的蛋白質(zhì)結構分析得,去離子水、NaCl洗脫液、PBS洗脫液洗脫得到的BHb分子結構保持良好,不易發(fā)生變性,而高濃度的尿素溶液以及SDS溶液洗脫得到的BHb結構發(fā)生了變化。最后,在經(jīng)過5次重復吸附洗脫實驗后,MIP顆粒對BHb分子的吸附量仍可以達到110 mg/g以上,顆粒具有良好的材料穩(wěn)定性和重復使用性。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ936;O631.3
【圖文】：

具有固定三維結構和確定排列功能團的空穴，并且這些空穴與模板60]。根據(jù)模板分子與功能單體之間的作用力種類可以將 MIT 分為印跡、半共價分子印跡、非共價分子印跡以及金屬絡合分子印跡。預定性、特異識別性和廣泛實用性等三大特點，使得 MIT 逐漸成學、醫(yī)學、環(huán)境科學、工業(yè)催化等領域交叉的新興技術。MIT 已經(jīng)在、模擬酶以及生物傳感器等方面顯示出巨大的應用前景[61]。印跡技術包含了三個主要環(huán)節(jié)，如圖 1-1 所示：選擇目標分子作為分子印跡的模板分子，選取合適的一種或多種須含有可以與模板分子適配結合的功能基團，選取可以結合功能單交聯(lián)劑，選擇合適的引發(fā)劑用于引發(fā)聚合反應。將模板分子與功能單體混合使其通過共價鍵或非共價鍵結合進行劑和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應，形成呈網(wǎng)絡狀的分子印跡聚合物。使用合適的洗脫液將模板分子從分子印跡聚合物上洗脫下來，在成具有一定大小、形狀和特定功能基團排列的孔穴，用于后續(xù)對�；蛭絒62, 63]。

3 結果與討論3.1 分子印跡磁性納米顆粒的制備MIP 的制備過程如圖 3-1 所示。采用化學共沉淀法在高轉速攪拌下制備出的 Fe3O4磁性納米顆粒具有粒徑小、比表面積大等特點，然而，由于其具有極強的超順磁性，彼此之間極易聚集。加入 TEOS 為磁顆粒表面引入 O-Si-O 基團，保護了 Fe3O4顆粒，使其彼此之間不易團聚，同時，避免了 Fe3O4顆粒表面被氧化。丙烯酸（AA）的加入，制備得到了 Fe3O4@SiO2-AA 顆粒，為 Fe3O4磁顆粒表面引入乙烯基和羧基，增加了磁顆粒表面的活性基團，為后續(xù)反應提供了結合位點[103]。加入 BHb 進行預組裝時，BHb 表面的-OH、-COOH 和-NH2等活性基團與 Fe3O4@SiO2-AA 顆粒表面的-OH 和-COOH 形成氫鍵結合，暫時固定于顆粒表面。而功能單體甲基丙烯酸和衣康酸以及交聯(lián)劑 N’N-MBA的加入，與 Fe3O4@SiO2-AA 顆粒表面的不飽和基團發(fā)生聚合反應，在磁顆粒表面形成了分子印跡聚合層。用洗脫液將聚合層中的 BHb 洗脫干凈后，分子印跡聚合顆粒表面便得到了許多三維形狀、大小以及功能基團均與模板蛋白 BHb 相匹配的孔穴。

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本文編號：2727425