【摘要】：近些年來,生物技術的快速發(fā)展極大的推動了生命科學和分析化學學科的發(fā)展。其中核酸放大技術作為分子生物學中的一項重要技術,因具有較高的靈敏度和較快的反應速率,備受研究者的青睞,被廣泛應用于生物分析、臨床診斷等領域。但是,實現(xiàn)目標物的實時、快速、靈敏檢測仍然是科研工作者追求的目標。本論文基于環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術,建立了幾種新型的LAMP方法用于microRNA、尿嘧啶-DNA糖基化酶活性、單核苷酸多態(tài)性以及致病菌基因的檢測。本論文建立的方法具有操作簡單、反應快速、靈敏度高以及特異性好等優(yōu)點。具體內(nèi)容如下:MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸的單鏈RNA,在基因調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用,發(fā)展一種準確、高效的miRNA檢測方法具有重要的意義。在第2章中,構建了一種基于連接的環(huán)介導等溫擴增(Ligation-LAMP)方法用于miRNA的高靈敏檢測。首先,將目標miRNA反轉(zhuǎn)錄成其互補DNA序列cDNA;然后,在連接酶的輔助作用下,以cDNA為模板連接兩條發(fā)夾探針,產(chǎn)生一個雙啞鈴結構的DNA分子;雙啞鈴結構DNA作為LAMP循環(huán)反應的引發(fā)物引發(fā)放大反應,最終產(chǎn)生大量的長度不一的莖-環(huán)結構DNA,利用SYBR Green I對產(chǎn)物進行染色,產(chǎn)生熒光增強信號。通過測定反應的實時熒光強度曲線,達到檢測目標miRNA的目的。與傳統(tǒng)的LAMP方法相比,該方法的獨特之處在于將高保真的Taq DNA連接酶引入LAMP反應用于產(chǎn)生雙啞鈴結構DNA,進而引發(fā)LAMP循環(huán)擴增。Taq DNA連接酶的引入使得本方法具有很好的單堿基錯配識別能力。此外,該方法可以實現(xiàn)從1 fM到1 nM濃度范圍內(nèi)miRNA的定量檢測,檢測下限為0.2 fM,可以用于復雜樣品中miRNA的檢測。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)參與DNA的堿基切除修復過程,是一種重要的DNA糖基化酶,在保持基因完整方面發(fā)揮著至關重要的作用。在第3章中,基于莖-環(huán)引物介導的指數(shù)放大(SPEA)反應發(fā)展了一種無需標記的高靈敏方法用于UDG的活性檢測。首先,UDG剪切掉輔助發(fā)夾探針HP上的尿嘧啶堿基產(chǎn)生一個脫堿基位點。這個脫堿基位點可以被溶液中存在的核酸內(nèi)切酶IV切割,釋放出一條單鏈DNA序列。這條單鏈DNA序列進而引發(fā)與另外兩條發(fā)夾探針H1和H2之間的鏈置換反應,產(chǎn)生一個雙啞鈴結構的DNA分子,進而引發(fā)LAMP反應的循環(huán)放大步驟,產(chǎn)生大量的莖-環(huán)結構DNA產(chǎn)物。利用雙鏈特異性染料SYBR Green I對DNA產(chǎn)物進行染色,產(chǎn)生熒光信號。通過監(jiān)測反應的實時熒光曲線,實現(xiàn)對UDG活性的分析測定。本方法采用SYBR Green I作為信號分子,無需熒光基團標記,檢測成本較低,可以實現(xiàn)1 mU/mL到1 U/mL濃度范圍內(nèi)UDG的活性檢測,檢測下限低至0.68 mU/mL,并且在實際體系中具有良好的檢測性能。另外,本方法還可以用于UDG抑制劑的測定。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是人類可遺傳變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上,發(fā)生在基因編碼區(qū)的SNP與許多疾病有關,因此SNP的檢測對臨床診斷和疾病治療具有十分重要的意義。在第4章中,將具有單堿基識別能力的RNase H2酶引入到環(huán)介導等溫擴增方法中,發(fā)展了一種簡單、高效的引物激活LAMP(PA-LAMP)方法用于SNP的特異性檢測。設計一條單堿基錯配識別探針BIP,在靠近其3’端修飾一個和突變目標互補的RNA堿基,并且在3’末端修飾一個C3 spacer以防止聚合酶的延伸。當突變目標存在時,BIP和目標DNA在RNA堿基位置完全互補,RNase H2酶切斷RNA堿基上游的磷酸二酯鍵,產(chǎn)生一個帶有羥基的3’末端,激活BIP作為引物引發(fā)LAMP反應的放大步驟。在此放大反應中,由于BIP需要被RNase H2酶切割才能被聚合延伸,所以SNP可以被反復識別,這大大提高了本方法的選擇性。該方法可以達到近10000倍的錯配區(qū)分率,可以檢測到濃度低至22 aM的突變目標,并且能夠用于實際基因組樣品中SNP的檢測。第5章中,建立了一種基于PA-LAMP方法的艱難梭菌和嗜肺軍團菌雙重檢測策略。首先針對兩種目標的致病基因序列分別設計一套高效的引物,在靠近FIP的3’端修飾一個RNA堿基,作為RNase H2酶的識別位點。然后在此RNA堿基的兩側分別標記一個熒光團和一個淬滅團,其中艱難梭菌和嗜肺軍團菌的FIP分別標記不同熒光團。當與其引物對應的目標序列存在時,RNase H2酶就會循環(huán)切割并激活含有RNA堿基的FIP引物引發(fā)LAMP反應,熒光恢復產(chǎn)生相對應的熒光基團的熒光信號,通過測定這兩種熒光信號的實時熒光曲線,實現(xiàn)對兩種致病菌的同時檢測。該方法不僅具有較好的靈敏度和特異性,并且可以用于細菌基因組提取樣品中艱難梭菌和嗜肺軍團菌的同時檢測,為LAMP方法的進一步發(fā)展應用奠定了基礎。
【圖文】：

LAMP反應的原理示意圖

增加兩條環(huán)引物的LAMP反應的原理示意圖
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;Q503

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