【摘要】：酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白質(zhì)或RNA)。酶活性的異常通常與一些重大疾病相關(guān)。酶活性的測(cè)定已成為基礎(chǔ)研究、疾病早期診斷、藥物篩選以及靶向治療的重要方法。傳統(tǒng)的酶活性測(cè)定方法需要試劑的量大、費(fèi)用高、分析時(shí)間長(zhǎng),因此需要開(kāi)發(fā)靈敏、快速、微量的分析新方法。熒光相關(guān)光譜法(Fluorescence correlation spectroscopy,FCS)是一種單分子檢測(cè)方法,具有靈敏度高、分析時(shí)間短、檢測(cè)體積小等優(yōu)點(diǎn),適用于酶活性的測(cè)定和酶抑制劑的篩選。本論文建立了FCS檢測(cè)端粒酶活性的新方法,發(fā)展了微孔芯片-熒光相關(guān)光譜(Microwell chip-fluorescence correlation spectroscopy,MC-FCS)系統(tǒng),并以MC-FCS系統(tǒng)進(jìn)行了含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)活性的檢測(cè)研究。本論文的主要內(nèi)容包括以下的幾個(gè)方面:(1)將單分子熒光相關(guān)光譜(FCS)與端粒酶重復(fù)擴(kuò)增法(Telomerase repeat amplification protocol,TRAP)相結(jié)合,發(fā)展了一種超靈敏和可靠的定量測(cè)定端粒酶活性的新方法(TRAP-FCS)。端粒酶是一種維持端粒長(zhǎng)度的關(guān)鍵酶,且由于其在癌癥和衰老中的重要作用,被認(rèn)為是一種通用的癌癥生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶標(biāo)。由于端粒酶在細(xì)胞內(nèi)的含量水平非常低,因此有必要開(kāi)發(fā)一種靈敏可靠的端粒酶活性檢測(cè)方法。TRAP-FCS方法的原理是利用FCS對(duì)TRAP產(chǎn)物的特征擴(kuò)散時(shí)間和粒子數(shù)目的變化進(jìn)行測(cè)量。其特征擴(kuò)散時(shí)間與TRAP產(chǎn)物的長(zhǎng)度有關(guān),粒子數(shù)目代表了TRAP產(chǎn)物的濃度。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了TRAP程序和FCS檢測(cè)的條件。我們發(fā)現(xiàn),端粒酶活性與TRAP產(chǎn)物在最佳實(shí)驗(yàn)條件下的特征擴(kuò)散時(shí)間和粒子數(shù)呈正相關(guān)。該方法成功地測(cè)定了不同細(xì)胞個(gè)數(shù)和細(xì)胞系的端粒酶活性,實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞檢測(cè)。同時(shí),采用該方法對(duì)抑制劑的抑制效果進(jìn)行了評(píng)價(jià),得到IC_(50)值與文獻(xiàn)資料基本一致。與目前的TRAP方法相比,該方法具有可靠的定量、超高的靈敏度、較短的檢測(cè)時(shí)間和無(wú)需分離等優(yōu)點(diǎn)。我們認(rèn)為T(mén)RAP-FCS方法在端粒酶活性檢測(cè)的臨床診斷和藥物篩選中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。(2)自行制作了一種PDMS/玻璃的微孔芯片,實(shí)現(xiàn)其與FCS檢測(cè)方法聯(lián)用,建立了MC-FCS方法。首先制作了適合于FCS檢測(cè)的PDMS/玻璃微孔芯片。采用薄膜封裝減小了芯片孔中微量的樣品蒸發(fā),還采用表面活性劑動(dòng)態(tài)修飾的方法消除了樣品的非特異性吸附。在優(yōu)化后的條件下,玻片和芯片上的樣品檢測(cè)結(jié)果基本一致,微孔芯片成功地用于熒光相關(guān)光譜系統(tǒng)檢測(cè)。優(yōu)化了芯片孔徑的大小,芯片最佳孔徑為0.9 mm。進(jìn)而,我們優(yōu)化了樣品溶液的體積,顯著地減少樣品體積至1μL。MC-FCS系統(tǒng)與現(xiàn)有的FCS方法相比,顯著地減少了樣品和試劑體積,極大地降低了酶活性測(cè)定和藥物篩選的成本。(3)基于MC-FCS技術(shù),提出了Caspase-3活性及其抑制常數(shù)測(cè)定新方法。Caspase-3是細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育和體內(nèi)平衡過(guò)程中細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,而且是治療細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病中一個(gè)非常重要的潛在藥物靶點(diǎn)。到目前為止,還沒(méi)有用于Caspase-3靶點(diǎn)的商業(yè)藥物,因此急需開(kāi)發(fā)Caspase-3活性檢測(cè)和抑制劑篩選的有效方法。我們方法的原理是基于FCS測(cè)量酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和均相檢測(cè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物。該MC-FCS系統(tǒng)可以顯著地降低樣品體積至1μL。實(shí)驗(yàn)使用了熒光染料和生物素雙重標(biāo)記的Caspase-3底物。在產(chǎn)物中添加的鏈霉親和素不僅可以快速地終止酶反應(yīng),還由于增大了分子量差距使得反應(yīng)產(chǎn)物也可以被FCS選擇性的檢測(cè)。我們將FCS理論與酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)合,建立了Caspase-3抑制劑的篩選模型。該新方法成功地用于抑制劑的抑制常數(shù)的測(cè)定以及藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。與現(xiàn)有的方法相比,該方法靈敏度高、試劑用量小、分析時(shí)間短。我們相信該系統(tǒng)和方法將成為對(duì)Caspase-3抑制劑篩選和細(xì)胞凋亡檢測(cè)的有效平臺(tái)。
【圖文】：

4圖 1-1 FCS 檢測(cè)的基本原理。Fig.1-1 Principle of FCS detection.通過(guò)熒光波動(dòng)自相關(guān)函數(shù)擬合得到的自相關(guān)曲線可以提供以下幾個(gè)方面的信息：擬合曲線 G(0)值的大小反比于檢測(cè)微區(qū)內(nèi)熒光分子的平均數(shù)量；曲線隨時(shí)間衰退的速率和形態(tài)可以顯示出檢測(cè)微區(qū)內(nèi)熒光分子擴(kuò)散變化的動(dòng)力學(xué)特征；依據(jù)熒光強(qiáng)度和熒光分子的數(shù)量還可以得到單個(gè)粒子的熒光強(qiáng)度等。歸一化的 FCS 曲線如圖 1-2A 所示，隨著熒光分子的結(jié)合變大和特征擴(kuò)散時(shí)間的變慢，F(xiàn)CS 的曲線會(huì)逐漸右移。自相關(guān) FCS 曲線如圖 1-2B 所示，隨著熒光分子濃度的增加，粒子數(shù)目增加，，F(xiàn)CS 的曲線 G(0)值的大小會(huì)逐漸下降。這是當(dāng) FCS 的曲線發(fā)生變化時(shí)所代表的意義。通過(guò)計(jì)算可以得到熒光分子的濃度、擴(kuò)散系數(shù)、反應(yīng)常數(shù)等一系列重要的參數(shù)。

5S 的曲線變化圖。（A）歸一化的 FCS 曲線反映了擴(kuò)散時(shí)間和分子大（B）FCS 曲線反映了粒子數(shù)和濃度的變化。inciple of FCS detection. (A) Normalized autocorrelation curves reflect thtime and molecular size. (B) FCS autocorrelation curves reflect the changnumbers and concentration.FCS 的理論公式微區(qū)內(nèi)熒光信號(hào)的強(qiáng)度在任一時(shí)間 t 的變化引起的漲落值為：F(t) = F(t) - F(t)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q55;O657.3

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 梁璋儀,趙新生;活細(xì)胞內(nèi)單個(gè)分子熒光檢測(cè)[J];大學(xué)化學(xué);2005年02期

2 康夢(mèng)奎;張素珍;姜泗長(zhǎng);楊靜琴;郭中和;;應(yīng)用血卟啉-激光光敏診斷鼻咽、喉部腫瘤[J];應(yīng)用激光;1987年01期

3 丁文娣;徐松林;張仁斌;;鄰苯二甲醛熒光檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究[J];分析化學(xué);1987年01期

4 僗大奎,劉亞淑,瞿永華,吳一遷;低濃度O~6甲基鳥(niǎo)嘌呤熒光檢測(cè)的研究[J];光學(xué)學(xué)報(bào);1988年08期

5 孟繼武,侯尚公,徐敘tb,馬煥璞,王德盛,祖淑清,房長(zhǎng)茂;癌患者血清的特異熒光研究[J];科學(xué)通報(bào);1988年08期

6 于治國(guó),王桂花,魏紅;高效液相色譜法測(cè)定血清及尿中卡那霉素含量[J];沈陽(yáng)藥學(xué)院學(xué)報(bào);1989年02期

7 徐靜;楊春光;肖珊珊;王江紅;王嘉;王丹;劉慧穎;曹際娟;;熒光檢測(cè)食品法標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2015年01期

8 施朝霞;常麗萍;曹全君;;基于CMOS傳感芯片的熒光檢測(cè)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];半導(dǎo)體光電;2014年03期

9 任河山;;ATP生物熒光檢測(cè)計(jì)的使用[J];啤酒科技;2012年11期

10 詹福如;許永建;陳連運(yùn);吳李君;余增亮;;單離子束在線熒光檢測(cè)技術(shù)[J];生物物理學(xué)報(bào);2009年S1期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 彭年才;苗保剛;李政;孫堯;;高靈敏熒光檢測(cè)在生物檢測(cè)儀器中的應(yīng)用[A];2013年（第五屆）西部光子學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2013年

2 馮端;張陽(yáng)陽(yáng);馬會(huì)民;;基質(zhì)金屬蛋白酶的高靈敏熒光檢測(cè)方法[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2012年

3 許麗麗;才紅;羅東;李冕;李丹;;對(duì)金屬離子具有熒光傳感功能的金屬有機(jī)框架[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第八屆全國(guó)配位化學(xué)會(huì)議論文集-論文[C];2017年

4 易濱;劉軍;王芳;涂顯春;趙曉曉;趙江麗;;ATP生物熒光檢測(cè)技術(shù)與菌落數(shù)和血液的相關(guān)性研究[A];中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)第十八屆全國(guó)醫(yī)院感染管理學(xué)術(shù)年會(huì)論文資料匯編[C];2011年

5 王開(kāi)宇;蘭小鵬;;以Picogreen為信號(hào)分子的非標(biāo)記型適配子熒光檢測(cè)新方法的建立[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

6 李莎;黃鵬程;吳芳英;;基于谷胱甘肽修飾的金納米簇?zé)晒鈾z測(cè)肝素[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第30屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集-第四分會(huì)：生物分析和生物傳感[C];2016年

7 韓從會(huì);黃克靖;;固相微萃取高效液相色譜分離熒光檢測(cè)尿樣中巰基化合物[A];河南省化學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2010年

8 田丹;王官耀;常澤;阮文娟;李?lèi)?卜顯和;;金屬有機(jī)框架熒光檢測(cè)材料研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集——第13分會(huì)：晶體工程[C];2014年

9 ;犬17A STR熒光檢測(cè)試劑盒[A];第十五次全國(guó)養(yǎng)犬學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第七次全國(guó)小動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

10 彭浩原;孫菲菲;孔靖元;趙婷婷;張素霞;曹興元;;莫西克汀在豬血漿中高效液相色譜-熒光檢測(cè)分析方法的建立與確證[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)與中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)第5次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 西南科技大 王順利 尚麗平 李占鋒 鄧琥 武志翔;一種廢水厭氧降解狀態(tài)在線熒光檢測(cè)方法(下)[N];電子報(bào);2012年

2 ;達(dá)安基因(002038)多項(xiàng)試劑完成CE認(rèn)證[N];中國(guó)證券報(bào);2008年

3 西南科技大 王順利 尚麗平 李占鋒 鄧琥 武志翔;一種廢水厭氧降解狀態(tài)在線熒光檢測(cè)方法(上)[N];電子報(bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王盼;熒光聚芳醚腈的結(jié)構(gòu)與性能研究[D];電子科技大學(xué);2019年

2 胡雪;銅納米簇及其復(fù)合物的分析應(yīng)用研究[D];西南大學(xué);2019年

3 李慧玉;高性能熒光碳點(diǎn)的制備、光學(xué)性能與應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2019年

4 鞠博;多色可調(diào)碳點(diǎn)的合成、發(fā)光機(jī)制及熒光傳感應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2019年

5 蘇迪;熒光相關(guān)光譜測(cè)定酶活性新方法研究[D];上海交通大學(xué);2018年

6 賀永桓;2-(2-羥基苯基)苯并咪唑合成及其在熒光檢測(cè)中的應(yīng)用[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

7 李波;高性能氮摻雜碳點(diǎn)的制備、性質(zhì)及應(yīng)用研究[D];蘭州大學(xué);2017年

8 王曉;熒光組裝體和室溫磷光材料的設(shè)計(jì)與應(yīng)用[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2019年

9 李穎;熒光碳點(diǎn)的制備與性質(zhì)研究[D];華東師范大學(xué);2017年

10 嚴(yán)韓;新型光功能有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、合成及其性質(zhì)研究[D];南京大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王大鵬;POSS-P(NIPAm-co-NBDAE)的可控合成及其熒光響應(yīng)行為[D];合肥工業(yè)大學(xué);2019年

2 吳可;含氮類(lèi)富電子金屬-有機(jī)框架的合成及其熒光傳感性能的研究[D];安徽理工大學(xué);2019年

3 趙瑞瑞;含氮雜環(huán)有機(jī)小分子熒光化合物的設(shè)計(jì)、合成及性質(zhì)研究[D];云南大學(xué);2017年

4 譚力;稀土基金屬-有機(jī)框架材料的設(shè)計(jì)合成及其對(duì)離子的熒光探測(cè)[D];浙江大學(xué);2019年

5 祝寶雅;硅納米顆粒的設(shè)計(jì)制備及檢測(cè)重金屬和顯現(xiàn)潛指紋的應(yīng)用[D];哈爾濱師范大學(xué);2019年

6 于麗穎;多功能熒光碳點(diǎn)的設(shè)計(jì)制備及其在重金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用[D];哈爾濱師范大學(xué);2019年

7 路晨;PEI改性熒光碳點(diǎn)的制備與分析應(yīng)用[D];天津大學(xué);2018年

8 方曉玲;光譜流式細(xì)胞儀熒光采集系統(tǒng)研制[D];廈門(mén)大學(xué);2018年

9 劉娜;具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的新型二乙烯基蒽衍生物的合成及熒光傳感研究[D];重慶師范大學(xué);2019年

10 宮福昕;電化學(xué)法合成UIO-66-NH_2及熒光檢測(cè)性能研究[D];哈爾濱理工大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2654545