【摘要】：細胞成像能夠提供細胞內(nèi)生物分子的空間分布情況,對了解細胞的生理學過程至關(guān)重要。細胞成像與熒光檢測有效結(jié)合,可以提供更加豐富的信息。DNA因其生物兼容性、水溶性、可調(diào)控性、靶向性等諸多生物學功能,而被廣泛用于熒光生物探針的構(gòu)建。DNA功能化納米熒光探針集納米材料和DNA的特性于一體,成為熒光檢測和成像分析的有力工具。但常用的DNA功能化納米熒光探針多為單發(fā)射探針,易受細胞攝入量、探針濃度、光程長度等因素的影響,造成熒光信號波動。而雙發(fā)射比率熒光探針可以克服以上缺陷。因此,構(gòu)建新型DNA功能化納米熒光比率探針并將其應用于生化檢測與成像分析具有重要的意義。本論文作者制備了 DNA功能化硅點熒光探針,并將其用于核酸、蛋白、金屬離子及氫離子檢測,并用所構(gòu)建的雙發(fā)射比率熒光探針,分別實現(xiàn)了細胞雙色熒光成像分析、細胞靶向識別及亞細胞器—溶酶體的雙色熒光成像分析。主要研究內(nèi)容如下:(1)建立了檢測疾病相關(guān)微小核糖核酸miRNA-27a的新方法。基于硅點(SiND)對花青染料Cy5標記的單鏈DNA(Cy5-DNA)的熒光猝滅效應及靜電相互作用,制備了 Cy5-DNA/硅點探針。該探針與人工合成的miRNA-27a(S-miRNA-27a)互補雜交后,Cy5-DNA的熒光可以恢復。本方法采用T堿基替換U堿基的S-miRNA-27a作為目標物,可避免使用潛在致癌試劑焦碳酸二乙酯(DEPC)和生物酶,提高了體系的穩(wěn)定性。在最優(yōu)的實驗條件下,該方法的線性范圍為0.5-20 nM,檢出限為0.16nM,相對標準偏差為9%(c=1nM,n = 5)。將所建立的方法應用于人尿樣和血清中S-miRNA-27a目標物的分析,加標回收率為90%-122%,獲得滿意結(jié)果。(2)采用共價偶聯(lián)法,構(gòu)建了 6-羧基-X-羅丹明(Rox)標記的DNA功能化SiND比率熒光探針,基于T-Hg2+-T作用,建立了檢測人宮頸癌細胞HeLa中Hg2+的比率熒光方法。當存在Hg2+時,DNA可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),拉近了探針中Rox和SiND的距離,使Rox的熒光被SiND猝滅。紫外-可見光譜、熒光壽命等結(jié)果進一步表明,該比率熒光探針的信號變化僅與Hg2+有關(guān)。因此,用Rox的熒光作為響應信號,SiND的熒光作為參比信號,建立了比率熒光檢測Hg2+的方法。在最優(yōu)的實驗條件下,該方法的線性范圍為10-1500 nM,檢出限為9.2 nM,相對標準偏差為8.8%(c=50nM,n=7)。將方法應用于人尿樣和血清中Hg2+的分析,加標回收率為81-107%。通過DNA共價修飾硅點,既提高了硅點的耐酸堿性,也利于其在細胞中應用,實現(xiàn)了 HeLa細胞中Hg2+的可視化成像分析。(3)建立了檢測腫瘤標志物粘蛋白MUC1以及癌細胞的雙色熒光成像方法。通過將Cy5標記的MUC1的適配體S2.2共價偶聯(lián)到SiND上,制備了選擇性響應MUC1的比率熒光適配體探針(SiND-S2.2-Cy5)。當體系中不存在MUC1時,探針中Cy5的熒光可以被SiND猝滅;當存在MUC1時,S2.2與MUC1之間的作用能夠引起適配體結(jié)構(gòu)的變化,從而使熒光恢復。在最優(yōu)的實驗條件下,線性范圍為3.33-250nM,相對標準偏差為3.6%(c=10nM,n=7),檢出限為1.52nM,實現(xiàn)了人血清中MUC1的檢測,加標回收率為87-108%。所構(gòu)建的比率熒光探針可有效區(qū)分MUC1-陽性的人乳腺癌細胞MCF-7和MUC1-陰性的人乳腺正常細胞MCF-10A、非洲綠猴腎細胞Vero,實現(xiàn)了癌細胞和正常細胞的識別。(4)構(gòu)建了一種亞細胞器氫離子檢測的DNA適配體功能化SiNDL比率熒光探針。將熒光素FAM標記的核仁蛋白的適配體AS1411共價偶聯(lián)到SiND上,通過優(yōu)化SiND用量和適配體鏈長,構(gòu)建了最佳信號比值的pH比率熒光探針(SiND-Apt-FAM)。將同步熒光掃描法、熒光成像和流式細胞術(shù)相結(jié)合,研究了所構(gòu)建的熒光探針在細胞溶酶體中的應用。與正常細胞MCF-10A相比,該熒光探針可識別過表達核仁蛋白的MCF-7細胞和HeLa細胞,并有較寬的pH響應范圍(pH 4.5-8.0)。所構(gòu)建的探針能夠?qū)崿F(xiàn)MCF-7細胞溶酶體的雙色熒光成像及其氫離子的檢測(pH 5.1)。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3

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