【摘要】：近年來,以質(zhì)譜為分析平臺的糖鏈分析研究取得了很大程度進展。糖鏈的釋放和衍生化等樣品制備方法不斷得到豐富和改進,糖鏈的各種分析策略相繼建立起來,本文主要對糖鏈的定性分析方法做分析和總結(jié)。本論文采用化學(xué)酶標(biāo)記法,酶標(biāo)記是糖基化分析的最有前途的方法之一,因為其簡單:標(biāo)記發(fā)生在酶消化過程中,可以避免額外的試劑,額外的步驟和副反應(yīng)�；瘜W(xué)酶法因其溫和的反應(yīng)條件、高度的空間區(qū)域選擇性,避免了化學(xué)合成繁瑣的保護步驟而成為研究的熱點,為研究糖蛋白中的N-糖鏈,提供了新的思路。第一章緒論的主要內(nèi)容是糖蛋白糖鏈現(xiàn)狀以及與疾病有哪些關(guān)聯(lián),并且詳細說明糖蛋白的組成結(jié)構(gòu)和應(yīng)用。目前研究糖鏈的方法多用PNGaseF酶,但本文使用了胰蛋白酶,所以緒論部分對此進行了簡短介紹和說明,同時對最后一步轉(zhuǎn)糖基酶Endo-MN175Q的作用及優(yōu)點做出詳盡解釋。第二章實驗部分,著重說明實驗所需各種溶液的配制,以及實驗過程中涉及的脫鹽,胰蛋白酶切,丙酮富集糖肽,酶反應(yīng)條件及方法,并且通過最后優(yōu)化的方法對三種標(biāo)準(zhǔn)品進行定性檢測分析,結(jié)果較好。第三章結(jié)果與討論中,著重探討了三種糖蛋白分析方法,其中方法一是糖蛋白在Endo-MN175Q的作用下,直接將寡糖轉(zhuǎn)移到受體上。方法二使用PNGase F酶對糖鏈進行分析,將寡糖轉(zhuǎn)移到受體。而第三種方法是本文著重討論的方法,用胰蛋白酶將糖蛋白酶切,對肽鏈進行丙酮富集,而現(xiàn)在大多數(shù)論文的一般方法都是對肽段進行分析,而本文方法具有新穎性,采用丙酮富集糖肽的方法,將寡糖轉(zhuǎn)移至受體后與175Q酶反應(yīng),經(jīng)過譜圖檢測后發(fā)現(xiàn)丙酮富集糖肽方法效果非常好,隨后細致的探討了各步驟反應(yīng)條件優(yōu)化情況,確定了最終方法。然后將此方法應(yīng)用于三種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白,分別是牛胰核糖核酸酶B,卵清蛋白,胎球蛋白。其中著重突出了丙酮在-25度冰柜中,以及5倍體積量富集糖肽效果最好,檢測到的糖肽鏈最多。通過糖鏈在丙酮和水中的溶解度不同,而形成清液和沉淀,接著對沉淀進行丙酮富集,得到豐富的糖鏈信息。最后用Endo-M的突變體175Q酶進行轉(zhuǎn)移,效率高,結(jié)果好。以牛胰核糖核酸酶B共檢測到5種糖鏈,分別是M5N2,M6N2,M7N2,M8N2,M9N2。卵清蛋白檢測到5種,分別是M5N2,M6N2,M8N2,M3N4,M3N6。胎球蛋白檢測到 6 種,分別是 M3N4G2,M3N4G2Ac2,M3N4G2Ac3,M3N5G3Ac,M3N5G3Ac2,M3N6G4Ac4。本文建立高效、高選擇性的丙酮富集糖肽方法,利用175Q酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)特性,使用化學(xué)酶衍生化法對糖蛋白進行定性定量分析。
【圖文】：

加５ｍＵＥｎｄｏ－Ｍ－Ｎ１７５Ｑ酶５隊，在金屬浴３２°Ｃ條件下反應(yīng)３小時，反應(yīng)結(jié)束后加逡逑１０隊乙腈使酶失活，總體積為４０邋ｎＬ，進ＬＣ－ＭＳ液質(zhì)檢測分析。逡逑＿果如圖７所示。邐逡逑ｘｌＯ７邋＊ＳＳｌ邋ＴＩＣ邐Ｆｒａｇ－１３Ｓ．０Ｖ邋６６９．ｄ逡逑６－邋｜逡逑，｜邋Ａ－ＴＩＣ逡逑３－邐｜逡逑２．邐ｉ邋ｊ，逡逑０－１邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐邋邐邐，邐邐邐ｖ邋＂Ａ…N：二一工：－二、．“…丫．…｝．二；：二＂．．…．．．．．．．．．．．．．；Ｙ，………，…．…｜．．．．．．．＞．．，，ｖ．．ｒ．；．．，，ｖ．；，Ｔｒ（逡逑１５邋Ｉ６邋１？邋１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３邋２４邋ｉｆ）邋２６邋２：邋＾邋２９邋３０邋３１邋３２邋＾邋＾邋３６邋３６邋３７邋３８邋３９邋４０邋４邋１邋４２邋４邋３邋４４逡逑Ｃｍ＼ｔｓ邋ｖｓ．邋ｆ邋ｊｆｅｆｆｔｆｏ］邋（．ｉｎ）逡逑１２逡逑

圖９表示牛胰核糖核酸酶Ｂ經(jīng)過ＤＴＴ－ＩＡＡ變性處理后，直接與１７５Ｑ酶反應(yīng)，譜圖結(jié)逡逑果雖比熱變性清晰，但仍然只能檢測到兩種糖鏈，Ｍ５Ｎ２和Ｍ６Ｎ２。Ｃ－丨是Ｍ５Ｎ２的色譜逡逑圖ＥＩＣ，邋Ｃ－２是萃取后Ｍ５Ｎ２的質(zhì)譜圖ＥＳＩ，邋Ｄ＿１是Ｍ６Ｎ２的色譜圖ＥＩＣ，邋Ｄ－２是Ｍ６Ｎ２萃逡逑取后的質(zhì)譜圖ＥＳＩ。Ｍ６Ｎ２峰不是單獨尖峰，不是很清晰，需要放大后才可以找到相應(yīng)分逡逑子量。綜合兩種變性方法得到的ＬＣ－ＭＳ譜圖，這種將糖蛋白變性后，不經(jīng)任何處理直接逡逑與１７５Ｑ反應(yīng)的方法有局限性，不能有效轉(zhuǎn)移寡糖鏈。所以我們又繼續(xù)進行了其他方法的逡逑嘗試。逡逑３．邋４邋ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ酶切對糖肋分析逡逑根據(jù)文獻，一般方法基本是將糖蛋白變性，ＰＮＧａｓｅＦ酶切，純化分離，與１７５Ｑ酶反逡逑應(yīng)，所以我們根據(jù)論文對２種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白，牛胰核糖核酸酶Ｂ和胎球蛋白采用ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ逡逑酶切，得到寡糖，對糖鏈分析。逡逑ＰＮＧａｓｅＦ酶使用條件也比較麻煩，ｐＨ邋＝邋７．５緩沖溶液條件，還需要同ＳＤＳ，邋ＮＰ－４０搭逡逑配使用，這樣就會引起多余的雜質(zhì)，引出雜質(zhì)就要除去雜質(zhì)，這個過程浪費時間，也會浪逡逑１７逡逑
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q55;O657.63

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 徐長帥;利用HPLC/ESI-MS建立糖蛋白中N-糖鏈的分析方法[D];延邊大學(xué);2016年

本文編號：2622031