【摘要】：MicroRNAs(mi RNAs)作為一種新的生物標(biāo)志物,不僅參與生物體內(nèi)的基因調(diào)控,還與癌癥等重大疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,探索發(fā)展準(zhǔn)確的檢測(cè)miRNA的方法備受關(guān)注。本論文研究?jī)?nèi)容中,我們將催化發(fā)夾DNA組裝(CHA)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)兩種恒溫?zé)o酶擴(kuò)增技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相結(jié)合,建立了檢測(cè)miRNA的新方法。主要研究?jī)?nèi)容如下:一、結(jié)合金納米粒子(AuNPs)的CHA與魯米諾化學(xué)發(fā)光體系,建立了一種檢測(cè)miRNA的新方法。首先,我們?cè)O(shè)計(jì)了巰基(-SH)修飾的P1和生物素(biotin)修飾的P2(bio-P2)兩種發(fā)夾DNA探針。然后,將探針P1修飾在AuNPs表面。當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時(shí),其與探針P1的部分序列互補(bǔ)雜交,將P1發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,形成P1-miRNA中間體。該中間體可引發(fā)bio-P2發(fā)夾結(jié)構(gòu)展開,形成P1-P2雙鏈DNA。同時(shí),目標(biāo)miRNA被頂替下來。隨后,miRNA又可與AuNPs表面其余的P1探針作用,進(jìn)而與P2探針形成P1-P2雙鏈,如此循環(huán),發(fā)生CHA反應(yīng)。實(shí)現(xiàn)了bio-P2探針在金納米粒子表面的富集。再通過鏈霉親和素(STV)與biotin的特異性作用,將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的STV(STV-HRP)結(jié)合在AuNPs表面,經(jīng)過離心分離,利用HRP催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了miRNA的檢測(cè)。方法中,miRNA的線性范圍為5 pM-100pM,檢出限為1.7 pM。該方法操作簡(jiǎn)便,成本低,可為基于CHA反應(yīng)的miRNA檢測(cè)提供一種新策略。二、將HCR和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相結(jié)合,以AuNPs為載體,發(fā)展了靈敏檢測(cè)miRNA的新方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了三種發(fā)夾探針:H1,H2,H3。其中,發(fā)夾探針H1以-SH修飾,H2以botin修飾。探針H1通過Au-S鍵結(jié)合到AuNPs表面。當(dāng)反應(yīng)體系中含有目標(biāo)miRNA時(shí),其可與發(fā)夾探針H1作用,使其結(jié)構(gòu)打開,并釋放出HCR的引發(fā)序列。隨后,該引發(fā)序列引發(fā)探針H2和H3之間發(fā)生一系列的HCR。再基于STV和biotin之間的特異性相互作用,將STV-HRP結(jié)合到HCR產(chǎn)物上,應(yīng)用HRP-魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系,通過檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的檢測(cè)。方法可對(duì)濃度范圍在5 pM-100 pM之間的let-7a進(jìn)行靈敏檢測(cè),檢出限為0.13 pM。該方法為miRNA的分析檢測(cè)提供了一種新思路。
【圖文】：

NAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性小分子 RNA[1]，序列由 18 - 25遍存在于生物體中，在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)活動(dòng)中起著重要作用。研究表明，miRNAs 的非正常表達(dá)與人密切相關(guān)[2-4]。因此，miRNAs 作為一種疾病的臨床診斷和治療準(zhǔn)確檢測(cè)尤為重要。然而，由于 miRNAs 序列短，在細(xì)胞中的環(huán)境要求苛刻，其分析研究面臨巨大挑戰(zhàn)[5]。因此，開發(fā)簡(jiǎn)單檢測(cè)新方法具有重要意義。roRNA 的檢測(cè)方法iRNAs 的核糖核苷酸序列較短，在細(xì)胞內(nèi)含量低，且同源性異性靈敏檢測(cè)面臨挑戰(zhàn)[6]。迄今為止，已報(bào)道有多種檢測(cè) mi要有 Northern Blotting、微陣列芯片法、核酸擴(kuò)增等。rthern Blotting

河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文進(jìn)行分離，，分離出來的 RNA 轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜固相雜交，通過雜交結(jié)果對(duì)特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測(cè)、法檢測(cè)靈敏度低、步驟繁瑣耗時(shí)、所需樣品多，使其在 miRNA制。列芯片芯片是近年來在生物領(lǐng)域中發(fā)展起來的一項(xiàng)高通量分析技術(shù)tting 法相比，具有樣品用量少，時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn) miRN生化分析和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值[11-13]。
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 成永強(qiáng);李正平;王愈聰;范永山;;MicroRNA分析方法進(jìn)展[J];化學(xué)進(jìn)展;2010年08期

本文編號(hào)：2618595