【摘要】：光學純手性胺是一類具有重要應用價值的化合物,經常作為拆分劑和手性砌塊被廣泛用于醫(yī)藥、農業(yè)化學、精細化學等領域中。手性胺的合成方法包括化學法和生物法,相對于化學法,生物法因具有原子利用率高、選擇性高、副產物少、催化過程條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點,而被越來越多的用于手性胺的合成制備。其中,最近發(fā)展的胺脫氫酶催化酮不對稱還原胺化制備手性胺引起了學術界和工業(yè)界科研人員的廣泛關注,因為該反應利用廉價的無機銨為胺供體,產生的副產物只有水,是一種更加綠色的手性胺制備過程。但是目前這類酶主要是以天然的L-氨基酸脫氫酶為起始對象,利用蛋白質工程技術改造而來,因此所獲得的胺脫氫酶均為(R)-構型的酶,只能用來合成(R)-手性胺,迄今還未見有(S)-胺脫氫酶被報道。因此,本文主要目的是嘗試通過土壤篩選從自然環(huán)境中獲得具有酮不對稱還原胺化合成(S)-手性胺功能的微生物,為天然來源(S)-胺脫氫酶的鑒定提供研究基礎。首先,本文以(S)-α-苯乙胺為唯一氮源對土壤中的微生物進行分離篩選,得到了 2株具有酮不對稱還原胺化能力的菌株;以(4-氟苯基)丙酮作為復篩底物,對這兩株菌催化酮不對稱還原胺化的能力進行了考察。結果顯示菌株ES11在NH4C1的反應體系中可以高效轉化(4-氟苯基)丙酮為(S)4-氟-α-甲基苯乙胺,產物ee99%,因此被確定為本文的研究對象。通過形態(tài)學特征分析和16S rDNA的鑒定,確定該菌株為表皮短桿菌,命名為 Brevibacterium epidermidis ECU1015。其次,對B.epidermidis ECU1015的催化性能進行研究,結果表明:該菌株催化還原胺化(4-氟苯基)丙酮反應的最佳胺供體為NH4Cl,最佳濃度為1.25 M,最適反應溫度為30℃,最佳緩沖體系為KPB緩沖溶液(pH7.5,0.2M),最佳的助溶劑為DMSO;對于相應的脫氨化反應,最適反應溫度為30℃,最佳緩沖體系為Glycine/NaOH緩沖溶液(pH 10.5,0.2 M)。此外,高底物濃度不利于該菌株催化還原胺化反應和脫氨化反應。最后,在最適的反應條件下,將B.epidermidis ECU1015催化的外消旋4-氟-α-甲基苯乙胺動力學拆分和(4-氟苯基)丙酮不對稱還原胺化反應放大到100 mL反應規(guī)模,分別得到了(R)-和(S)-4-氟-α-甲基苯乙胺,ee均大于99%。這說明B.epidermidis ECU1015是一株具有酮不對稱還原胺化功能的微生物,為(S)-胺脫氫酶的獲取提供了研究對象。
【圖文】：

要的合成中間體。２００９年，羅格斯大學的Ｚｈａｎｇ課題組開發(fā)了一種新的催化反應路徑，逡逑借助于過渡金屬Ｒｈ實現(xiàn)了盡乙�；０返绞中园奉惢衔铮ǎ澹邋澹荆梗梗罚ィ┑牟粚ΨQ還原合逡逑成（圖１．４）問。逡逑２００８年，英國利物浦大學的Ｘｉａｏ和他的同事發(fā)現(xiàn)了一種新的Ｒｈ／二元胺催化劑，逡逑可以實現(xiàn)亞胺的不對稱還原反應［１４］。另外，基于對催化劑的穩(wěn)定性和操作的簡易性考慮，，逡逑多個研發(fā)團隊利用穩(wěn)定的有機氫供體替代傳統(tǒng)的氫供體成功地開發(fā)了新的催化反應體逡逑系。該不對稱還原反應既可以在傳統(tǒng)的催化反應體系（二氨基配體和Ｒｕ催化劑）中進行［１５］，逡逑也可以在有機相［１６］或水相［１７１中進行（圖１．５）。逡逑［ＲｕＬｊ邐0逡逑、0人人＾邋ｈｃ0２ｈ＇（0２Ｈ５＂３ｎ、。人入廣逡逑ｙｉｅｌｄ：邋８６％逡逑ｅｅ：邋９７％逡逑圖１．５邋Ｒｕ催化的亞胺不對稱還原反應逡逑Ｆｉｇ．邋１．５邋Ｒｕ－ｃａｔａｌｙｓｅｄ邋ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ邋ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｍｉｎｅ邋ｔｏ邋（５）－ｓａｌｓｏｌｉｄｉｎｅ．逡逑１．３．１．４酮還原胺化法逡逑0邐Ｎ邋八Ｐｈ逡逑ｎ邋ＴｉＣＩ４

邐ｏ２逡逑Ｒ１２＝Ｈ，ａｌｋｙｌ，ａｒｙｌ逡逑圖１．１９胺氧化酶催化的氧化去胺化路徑逡逑Ｆｉｇ．邋１．１９邋Ｇｅｎｅｒａｌ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｆｏｒ邋ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｕｓｉｎｇ邋ａｍｉｎｅ邋ｏｘｉｄａｓｅ．逡逑胺氧化酶是氧化還原酶家族中的一員（ＥＣ邋１．４．３．４）。該家族酶能夠催化氧化還原反應，逡逑尤其是單胺氧化酶能夠實現(xiàn)手性胺到酮的氧化過程，當?shù)孜餅椴窌r，可以實現(xiàn)伯胺到逡逑醛的轉化，并伴隨著氧氣到過氧化氫的還原過程［３４］，如圖１．１９所示。逡逑最近，Ｔｕｒｎｅｒ課題組對中的單胺氧化酶進行一系列改造，其突變逡逑體呈現(xiàn)出更廣的底物譜，并且具有非常高的催化活性和對映選擇性［３５］。在接下來的研究逡逑中，多個課題組以來自的單胺氧化酶突變體作為母本，針對不同的胺逡逑類化合物，進行了一系列的半理性和理性設計，獲取適應各個催化反應的突變體［３６＿４３］，逡逑如圖１．２０所示。逡逑個逡逑Ｉ邐８邐ｍ逡逑0邋ｈ邋邐逡逑Ｓ邐＿邐Ｄ５逡逑Ｓ－邐Ｄ８邐Ｆ２１０Ｌ逡逑0）邐Ｑ邋＇邐邐：－：邐Ｌ２１３Ｔ逡逑名邐Ｄ７邐Ｍ２４２Ｑ逡逑ｌ邐丨邐邐邐邋Ｍ２４６Ｔ逡逑ｉ邐ＡＸ邐Ｗ邐．邐５Ｔ＂１邐Ｗ４３０Ｈ逡逑ＣＯ邐ＮＨ
【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O621.251;TQ460.1;Q93

【參考文獻】

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1 尤忠毓;柳志強;鄭裕國;;新生物催化劑的篩選與開發(fā)[J];基因組學與應用生物學;2009年06期

本文編號：2613116