【摘要】：生物分子(核酸、蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞、組織和生物小分子等)的簡(jiǎn)單、快速及高效靈敏檢測(cè)在疾病診斷、食品藥品分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)和科學(xué)研究等方面具有十分重要的意義。隨著社會(huì)發(fā)展的需要,完善和發(fā)展操作更加簡(jiǎn)單、靈敏度更高、特異性更強(qiáng)以及檢測(cè)通量更高的生物傳感技術(shù)已成為生物分析領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本論文首先立足簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟、提高檢測(cè)靈敏度和特異性地需求,借助等溫酶輔助信號(hào)放大技術(shù)和DNA催化自組裝信號(hào)放大技術(shù)發(fā)展了新穎的可視化及熒光生物傳感體系并應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)分子的靈敏檢測(cè)。并通過(guò)對(duì)實(shí)際樣品(血清及細(xì)胞裂解液)中生物分子的分析檢測(cè),驗(yàn)證了這些方法的可行性、可靠性及適用性。為了進(jìn)一步深入研究單細(xì)胞內(nèi)多個(gè)RNA目標(biāo)物地表達(dá)及空間分布信息,本研究采用DNA四面體納米結(jié)構(gòu)及原位滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)分別對(duì)單細(xì)胞內(nèi)兩種重要RNA的分布及表達(dá)情況進(jìn)行了同時(shí)熒光成像分析,并對(duì)其相應(yīng)的檢測(cè)機(jī)理及檢測(cè)性能做了深入研究和探索。這些研究方法在檢測(cè)靈敏度、選擇性、適用性以及檢測(cè)通量等方面都取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體的研究工作歸納為以下幾個(gè)部分:1.二次循環(huán)信號(hào)放大策略免標(biāo)記靈敏可視化檢測(cè)HIV DNA近年來(lái),可視化檢測(cè)越來(lái)越受到廣大研究者地關(guān)注和青睞,因?yàn)榭梢暬瘷z測(cè)方法無(wú)需使用任何特殊先進(jìn)儀器即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)生物分子的快速檢測(cè)。然而,使用可視化方法實(shí)現(xiàn)痕量生物分子的檢測(cè)并達(dá)到與PCR方法相媲美的檢測(cè)靈敏度仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。本研究基于核酸外切酶III(Exo III)輔助的DNA循環(huán)和功能化DNA酶(辣根過(guò)氧化物模擬酶),發(fā)展了一種新型的二次循環(huán)信號(hào)放大策略用于目標(biāo)物HIV DNA的靈敏可視化檢測(cè)。當(dāng)有目標(biāo)物HIV DNA存在時(shí),在Exo III的輔助下可引發(fā)兩個(gè)獨(dú)立且同時(shí)進(jìn)行的DNA循環(huán)過(guò)程。該二次循環(huán)信號(hào)放大過(guò)程使得G-四倍體序列鎖定的兩個(gè)DNA發(fā)卡型探針被識(shí)別催化水解并最終釋放出大量自由的G-四倍體序列,這些G-四倍體序列可以和Hemin結(jié)合生成G-四倍體/Hemin辣根過(guò)氧化物模擬酶并催化溶液由無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色,通過(guò)溶液顏色地改變實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物HIV DNA低至2.5 pmol L~(-1)的靈敏可視化檢測(cè)。該可視化檢測(cè)方法采用未修飾DNA發(fā)卡型探針,避免了任何復(fù)雜和昂貴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)儀器地使用,因此在本質(zhì)上非常簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)。此外,該可視化檢測(cè)方法也展現(xiàn)出良好的單堿基錯(cuò)配識(shí)別能力。通過(guò)合理的探針設(shè)計(jì),該方法可被拓展應(yīng)用于其它DNA生物標(biāo)志物的靈敏可視化檢測(cè)。2.目標(biāo)物引發(fā)二次循環(huán)信號(hào)放大策略免標(biāo)記靈敏可視化檢測(cè)細(xì)胞因子基于脫氧核糖核酸酶(DNAzyme)探針的可視化生物檢測(cè)方法由于其簡(jiǎn)單的檢測(cè)機(jī)理近年來(lái)引起廣大研究者們的濃厚興趣。然而,要進(jìn)一步提升該可視化檢測(cè)方法的靈敏度并將其應(yīng)用范圍拓展到其它非核酸目標(biāo)物的檢測(cè)仍然面臨著兩個(gè)重大挑戰(zhàn)。在本研究體系中,我們巧妙設(shè)計(jì)了一個(gè)DNA發(fā)卡型適配體DNA酶探針并基于該發(fā)卡型探針發(fā)展了一個(gè)新的二次循環(huán)信號(hào)放大策略應(yīng)用于細(xì)胞因子的靈敏可視化檢測(cè)。當(dāng)出現(xiàn)目標(biāo)物細(xì)胞因子(干擾素γ,IFN-γ)時(shí),目標(biāo)物IFN-γ可與DNA發(fā)卡型探針的適配體序列特異性結(jié)合并將其打開(kāi),此時(shí)溶液中已經(jīng)存在的Bst-聚合酶和λ核酸外切酶可以協(xié)助實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物IFN-γ和一段DNA中間目標(biāo)物的同時(shí)循環(huán)并達(dá)到二次循環(huán)信號(hào)放大的效果。經(jīng)過(guò)該二次循環(huán)放大過(guò)程溶液中產(chǎn)生了大量的G四倍體序列,并可結(jié)合氯化血紅素(Hemin)生成大量G-四倍體/Hemin辣根過(guò)氧化物模擬酶(DNA酶),該模擬酶可催化無(wú)色的ABTS~(2-)變?yōu)榧由畹木G色并以此實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物IFN-γ的可視化高靈敏檢測(cè),裸眼檢測(cè)限可以低至50 pmol L~(-1)。再者,該可視化檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)物IFN-γ具有高度的選擇性,在均相溶液中使用未修飾的適配體DNA酶探針即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的可視化檢測(cè)。鑒于該方法所具備的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn),我們通過(guò)對(duì)檢測(cè)探針的合理再設(shè)計(jì)即可開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)平臺(tái)并實(shí)現(xiàn)對(duì)其它生物分子地檢測(cè)。3.RNA誘導(dǎo)催化自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞中miRNA的高靈敏檢測(cè)近年來(lái),微小RNA(miRNA)被作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于癌癥的早期檢測(cè)及相關(guān)研究。由于miRNA序列較短、家族同源序列相似度高、表達(dá)含量低和易降解等本質(zhì)特征,使得miRNA的高特異性準(zhǔn)確定量分析變得復(fù)雜。在本研究中,以癌細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA-21為引發(fā)劑,借助等溫足點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)催化DNA發(fā)卡型探針級(jí)聯(lián)組裝形成“煙花狀”DNA納米結(jié)構(gòu)并以此實(shí)現(xiàn)miRNA-21的熒光靈敏檢測(cè)。由于DNA納米結(jié)構(gòu)自組裝過(guò)程中引發(fā)劑miRNA-21被循環(huán)再利用,因此少量的目標(biāo)物miRNA-21可誘導(dǎo)催化自組裝形成大量的DNA納米結(jié)構(gòu)并實(shí)現(xiàn)熒光檢測(cè)信號(hào)的放大。本研究采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了DNA納米結(jié)構(gòu)的自組裝過(guò)程及自組裝時(shí)間對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)型的影響。miRNA-21引發(fā)DNA納米結(jié)構(gòu)自組裝技術(shù)作為一種新型的信號(hào)放大策略實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物miRNA-21的超靈敏熒光檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)了人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)中miRNA-21的熒光靈敏檢測(cè),并可檢測(cè)到低至10個(gè)癌細(xì)胞。因此,本研究工作為DNA納米結(jié)構(gòu)在各種癌癥早期診斷中的應(yīng)用提供了技術(shù)支持和新的機(jī)會(huì)。4.多色熒光編碼可變構(gòu)DNA納米結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)miRNAs的同時(shí)檢測(cè)近年來(lái),金納米顆粒和石墨烯被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)的分析研究,但在實(shí)際操作中這些納米材料往往需要復(fù)雜的制備過(guò)程和繁瑣的功能化步驟。同時(shí)這些無(wú)機(jī)材料自身的生物毒性使其在生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用方面一直存在著很大地爭(zhēng)議。在本研究工作中,我們利用DNA良好的生物相容性、無(wú)毒性和可控性等方面的顯著優(yōu)勢(shì),構(gòu)建了一個(gè)可重構(gòu)、多色熒光編碼DNA四面體納米結(jié)構(gòu)并將其應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)miRNAs的同時(shí)分析檢測(cè)。DNA四面體納米結(jié)構(gòu)探針是由四條單鏈寡核苷酸(ssDNA)通過(guò)簡(jiǎn)單的一步退火制得,其中兩條ssDNA包含兩個(gè)熒光淬滅的發(fā)卡型結(jié)構(gòu)。當(dāng)有目標(biāo)miRNA存在時(shí),兩個(gè)發(fā)卡型結(jié)構(gòu)被所對(duì)應(yīng)的miRNA特異性雜交打開(kāi)并恢復(fù)不同的熒光信號(hào)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的多重檢測(cè)。更為重要的是,和普通的DNA分子信標(biāo)相比較,DNA四面體納米結(jié)構(gòu)探針在細(xì)胞裂解物中具有良好的穩(wěn)定性,可高效穩(wěn)定地進(jìn)入細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)兩種不同miRNA的同時(shí)檢測(cè)。自組裝DNA四面體納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA的成功傳感分析為其在成像、藥物遞送和體內(nèi)癌癥治療中地深入應(yīng)用提供了有利的技術(shù)支持和潛能。5.可編程DNA環(huán)/發(fā)卡納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用于單細(xì)胞中多重mRNA的高靈敏成像近年來(lái)大量研究證明mRNA地表達(dá)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有十分密切的關(guān)系,且mRNA被作為一種新型的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于癌癥的早期診斷和機(jī)理探討。因此,單個(gè)癌細(xì)胞內(nèi)多種mRNA的同時(shí)原位檢測(cè)和成像對(duì)于癌癥早期檢測(cè)具有重要意義。本研究構(gòu)建了一個(gè)可編程DNA環(huán)/發(fā)卡納米結(jié)構(gòu),以細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)的兩種重要mRNA為引發(fā)劑啟動(dòng)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng),并通過(guò)不同熒光信號(hào)分子的識(shí)別雜交實(shí)現(xiàn)單個(gè)癌細(xì)胞中TK1和Survivin mRNA的同時(shí)原位熒光檢測(cè),且檢測(cè)分辨率接近單分子水平。與傳統(tǒng)的RCA成像方法相比較,本研究提出的原位RCA檢測(cè)方法操作步驟簡(jiǎn)單,成功避免了復(fù)雜的目標(biāo)mRNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程以及掛鎖DNA探針的連接過(guò)程。同時(shí),通過(guò)使用熒光淬滅的dsDNA信號(hào)探針顯著降低背景噪聲并使用發(fā)卡識(shí)別探針增強(qiáng)了檢測(cè)的選擇性。該研究方法利用原位滾環(huán)擴(kuò)增信號(hào)放大和多重?zé)晒鈾z測(cè)性能的優(yōu)勢(shì),實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞內(nèi)兩種低表達(dá)mRNA的原位放大檢測(cè)并有效抑制了假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生,為早期癌癥診斷提供了更加準(zhǔn)確和完整的參考信息。
【圖文】：

圖 1.1 生物傳感器原理圖Fig.1.1 Schematic diagram of biosensor1.3 信號(hào)放大技術(shù)在實(shí)際的生物檢測(cè)分析中，尤其是在疾病臨床早期診斷、食品藥品監(jiān)測(cè)、環(huán)

圖 1.2 核酸外切酶Ⅲ輔助的目標(biāo)物循環(huán)放大策略原理圖[7]。g. 1.2 Schematic illustration of exonuclease III aided target recycling strategy. Copyri2010ACS.
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.3

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本文編號(hào)：2594931