黑曲霉N5-5單寧酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
【圖文】：
Ｊ烞m和最大反應(yīng)速率vmax。Lineweaver-Burk方程如式（2）所示：1v＝Kmvmax1[S]1vmax（2）2結(jié)果與分析2.1SDS-PAGE分析將凝膠層析收集到的30管洗脫樣分別測(cè)定單寧酶活力（此處僅作比較，故以吸光度A270nm代表酶活力），將A270nm大于0.05的12～23號(hào)管蛋白作非還原SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)17號(hào)管蛋白電泳后的凝膠中僅有一條蛋白條帶，因此可確定該蛋白條帶為黑曲霉N5-5單寧酶。170kD130kD100kD70kD55kD45kD35kD25kD15kD1Marker21.還原SDS-PAGE；2.非還原SDS-PAGE。圖1純酶SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofpurifiedtannase由圖1可知，非還原電泳和還原電泳結(jié)果均顯示一條蛋白條帶，表明黑曲霉N5-5單寧酶是由一條肽鏈形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算其分子質(zhì)量為64.2kD，這與喻曉蔚[25]報(bào)道的黑曲霉單寧酶分子質(zhì)量較接近（63kD）。表1黑曲霉N5-5單寧酶純化效果Table1SummaryofthepurificationstepsoftannasefromAspergillusnigerN5-5單寧酶總體積/mL總酶活力/U酶活力/（U/mL）蛋白質(zhì)量濃度/（μg/mL）比活力/（U/μg）酶活力收率/%純化倍數(shù)粗酶1850871997471.35574.820.82100.001.00超濾酶463455879984.62213.124.6252.285.64純酶1252031721625.3899.3516.3623.3019.95由表1可知，黑曲霉N5-5單寧酶經(jīng)純化后，活力大大提升，相比粗酶可純化近20倍，酶活力可回收23.30%。雖然“超濾＋層析”法相比傳統(tǒng)方法并無(wú)純化倍數(shù)優(yōu)勢(shì)（如Mahendran等[16]采用傳統(tǒng)方法可使一種擬青霉單寧酶純化倍數(shù)達(dá)到30.5），但該法工藝周期相比傳統(tǒng)方法可縮短50%以上，，且獲得的純酶經(jīng)電泳分析（圖1）未見(jiàn)雜蛋白條帶，可見(jiàn)純化效果良好。
Ｊ烞m和最大反應(yīng)速率vmax。Lineweaver-Burk方程如式（2）所示：1v＝Kmvmax1[S]1vmax（2）2結(jié)果與分析2.1SDS-PAGE分析將凝膠層析收集到的30管洗脫樣分別測(cè)定單寧酶活力（此處僅作比較，故以吸光度A270nm代表酶活力），將A270nm大于0.05的12～23號(hào)管蛋白作非還原SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)17號(hào)管蛋白電泳后的凝膠中僅有一條蛋白條帶，因此可確定該蛋白條帶為黑曲霉N5-5單寧酶。170kD130kD100kD70kD55kD45kD35kD25kD15kD1Marker21.還原SDS-PAGE；2.非還原SDS-PAGE。圖1純酶SDS-PAGE分析Fig.1SDS-PAGEanalysisofpurifiedtannase由圖1可知，非還原電泳和還原電泳結(jié)果均顯示一條蛋白條帶，表明黑曲霉N5-5單寧酶是由一條肽鏈形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算其分子質(zhì)量為64.2kD，這與喻曉蔚[25]報(bào)道的黑曲霉單寧酶分子質(zhì)量較接近（63kD）。表1黑曲霉N5-5單寧酶純化效果Table1SummaryofthepurificationstepsoftannasefromAspergillusnigerN5-5單寧酶總體積/mL總酶活力/U酶活力/（U/mL）蛋白質(zhì)量濃度/（μg/mL）比活力/（U/μg）酶活力收率/%純化倍數(shù)粗酶1850871997471.35574.820.82100.001.00超濾酶463455879984.62213.124.6252.285.64純酶1252031721625.3899.3516.3623.3019.95由表1可知，黑曲霉N5-5單寧酶經(jīng)純化后，活力大大提升，相比粗酶可純化近20倍，酶活力可回收23.30%。雖然“超濾＋層析”法相比傳統(tǒng)方法并無(wú)純化倍數(shù)優(yōu)勢(shì)（如Mahendran等[16]采用傳統(tǒng)方法可使一種擬青霉單寧酶純化倍數(shù)達(dá)到30.5），但該法工藝周期相比傳統(tǒng)方法可縮短50%以上，且獲得的純酶經(jīng)電泳分析（圖1）未見(jiàn)雜蛋白條帶，可見(jiàn)純化效果良好。
【作者單位】： 肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院;
【基金】：廣東高校國(guó)際科技合作創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目(2013gjhz0003)
【分類號(hào)】：O629.8
【參考文獻(xiàn)】
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2 謝曉莉;劉明;邱樹(shù)毅;李廣神;吳鑫穎;;黑曲霉B0201液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶最佳工藝條件研究[J];中國(guó)釀造;2010年08期
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【共引文獻(xiàn)】
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3 張帥;朱華偉;農(nóng)嘉儀;林健輝;曹庸;;均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化黑曲霉N5-5固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶[J];食品科技;2016年09期
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5 王揮;黃壽恩;顏紅;黎繼烈;李忠海;;單寧酶制備研究進(jìn)展[J];食品與機(jī)械;2012年03期
6 馬如意;趙祥穎;劉建軍;;單寧酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J];中國(guó)釀造;2011年06期
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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】
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8 馬如意;單寧酶產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年
9 陶素芬;單寧酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D];山東輕工業(yè)學(xué)院;2011年
10 周紀(jì)東;黑曲霉產(chǎn)單寧酶的研究和有機(jī)相中固定化黑曲霉細(xì)胞生物合成沒(méi)食子酸丙酯的初探[D];浙江大學(xué);2002年
本文編號(hào)：2552594
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