【摘要】：線粒體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器,參與細(xì)胞新陳代謝過程的能量循環(huán)以及離子平衡過程,在細(xì)胞生理過程中具有極其重要的意義。一些小分子熒光染料/探針結(jié)構(gòu)中帶有正電荷,因受到線粒體內(nèi)膜負(fù)電勢(shì)的牽引而標(biāo)記在線粒體上,為研究線粒體的形態(tài)或功能提供了重要的可視化成像工具。然而,大多數(shù)線粒體染料/探針對(duì)線粒體的靶向標(biāo)記穩(wěn)定性仍不夠理想,因?yàn)榫�粒體電勢(shì)處于不斷的動(dòng)態(tài)變化中,當(dāng)電勢(shì)降低時(shí),對(duì)染料的親和力相應(yīng)降低。尤其在病理?xiàng)l件下(比如細(xì)胞凋亡)細(xì)胞代謝受到阻滯時(shí),線粒體膜電勢(shì)顯著降低,陽離子染料將擴(kuò)散離開線粒體,造成非特異性熒光。最近,Kim團(tuán)隊(duì)和本人課題組提出可固定線粒體探針的新概念,用活性基團(tuán)將熒光分子探針通過共價(jià)鍵固定在線粒體中,開發(fā)了穩(wěn)定靶向線粒體中的定量探測微環(huán)境p H值、粘度、膜電勢(shì)熒光探針。我們認(rèn)為,對(duì)于追蹤和探測具有高度動(dòng)態(tài)變化特性的線粒體而言,開發(fā)可固定的線粒體熒光分子探針是必然趨勢(shì),因此本文進(jìn)行評(píng)述和展望。
【圖文】：

噬過程中均伴隨著pH變化。研究線粒體pH變化的常規(guī)方法是通過現(xiàn)有的細(xì)胞質(zhì)pH熒光探針對(duì)固定后的線粒體進(jìn)行研究，這一方法并不能真實(shí)地展現(xiàn)線粒體發(fā)生病理變化時(shí)的pH變化［42］。生物學(xué)的方法是通過基因編輯技術(shù)將pH敏感的綠色熒光蛋白表達(dá)在線粒體中，該方法能夠?qū)崟r(shí)展示線粒體的pH變化，但是該方法步驟繁瑣并不能像小分子熒光探針那樣快速簡易地展示線粒體pH變化［43］。Kim等［44］首次設(shè)計(jì)了能夠固定于線粒體中的pH敏感型熒光探針1。該熒光探針通過季擕鹽對(duì)線粒體進(jìn)行標(biāo)記并通過芐氯基團(tuán)使其固定在線粒體中。圖1探針1的化學(xué)結(jié)構(gòu)及線粒體pH檢測機(jī)理［44］Fig．1Structureofprobe1andproposedmitochondrion-specificpHsensingmechanismforprobe1［44］探針分子1通過分子內(nèi)PET效應(yīng)來控制其發(fā)光性能，對(duì)環(huán)境中的pH變化較為敏感，在pH值為2～11內(nèi)具有很好的熒光強(qiáng)度變化。探針分子1對(duì)線粒體染色后通過CCCP(羰基氰化氯萃腙)刺激來降低線粒體膜電位，熒光成像照片顯示，線粒體膜電位降低后該分子仍能很好地標(biāo)記在線粒體內(nèi)。該研究通過對(duì)外源性pH進(jìn)行調(diào)整并以MTＲ(MitoTrackerＲed，商業(yè)化線粒體固定染料)為內(nèi)標(biāo)繪制了不同pH下比率值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過比率成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常細(xì)胞和饑餓細(xì)胞的線粒體內(nèi)pH值的測定。同時(shí)，細(xì)胞饑餓處理會(huì)引發(fā)細(xì)胞自噬過程進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，該研究通過對(duì)線粒體和溶酶體進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測了細(xì)胞饑餓引發(fā)自噬過程中的pH變化。通過固定于線粒體的pH探針對(duì)線粒體內(nèi)的pH變化進(jìn)行研究，打破了常規(guī)的研究方法，能夠?qū)崟r(shí)地區(qū)分正常和病態(tài)的線粒體，為研究線粒體生理過程及藥物設(shè)計(jì)提供了很好的工具和啟示。3．2可固定線粒體膜電位探針線粒體中pH變化究其本源終究是線粒體膜電位的變化。對(duì)線粒體膜電位變化進(jìn)行探

圖2探針分子1和MTＲ對(duì)HeLa細(xì)胞的線粒體pH的檢測成像［44］Fig．2MitochondrialpHdeterminationinHeLacellsusingprobe1andMitoTrackerＲed［44］(a)Confocalmicroscopyimagesof1(5.0μmol/L)andMitoTrackerＲed(MTＲ)(0.1μmol/L)infixedcellsexposedtoexternalmediafixedatpH5，6，，7，and8，respectively．(b)IntracellularpHcalibrationcurveconstructedbyplottingIgreen/IredvspH．Thedotsarebasedontheaveragewiththeindicatedstandarderror．ThetableprovidestheaveragepHvaluesofthemitochondriainintactandnutrient-deprivedcells．(c)Imagesof1andMTＲinintactcells圖3MITFPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)及工作機(jī)理［45］Fig．3StructureandworkingprincipleofbipolarandfixableMITFPS［45］線粒體中不同位置的膜電位變化，還可以通過CCCP刺激細(xì)胞時(shí)線粒體膜電位喪失，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地檢測線粒體在去極化過程中的膜電位變化。如圖4所示，隨著CCCP刺激的時(shí)間延長，探針分子的熒光壽命逐漸增強(qiáng)，通過對(duì)不同區(qū)域的熒光壽命進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，探針分子在線粒體去極化過程中熒光壽命平均增加約20%，實(shí)現(xiàn)了對(duì)線粒體內(nèi)膜去極化過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。這一研究通過將具有固定結(jié)構(gòu)的極性敏感熒光探針引入并固定在線粒體中，能夠更為精準(zhǔn)地展示線粒體膜電位的變化，同時(shí)為研究線粒體病理過程提供了優(yōu)良的工具。3．3可固定線粒體粘度探針線粒體的微環(huán)境不僅僅局限于pH和膜電位，線粒體基質(zhì)不同狀態(tài)下的粘度同樣對(duì)線粒體的生理過程有著極其重要的影響。線粒體基質(zhì)粘度變化對(duì)線粒體形貌、代謝產(chǎn)物擴(kuò)散等過程有著重要影響，與眾多疾病和細(xì)胞病變息息相關(guān)。有關(guān)線粒體粘度變化的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。我們團(tuán)隊(duì)首次設(shè)計(jì)合成了能夠固定在線粒體中的粘度探針Vis-A和對(duì)比探針分子Vis-B［45］。Vi
【作者單位】： 大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(21174022,21376038,21421005,21576040) 國家重大基礎(chǔ)研究專項(xiàng)基金(2013CB733702)資助~~
【分類號(hào)】：O657.3;Q244


本文編號(hào)：2526291