【摘要】：目的:構建中國對蝦蛋白致敏小鼠模型并研究關鍵過敏原。方法:采用液氮研磨結合裂解液裂解對蝦肌肉提取蛋白浸出液,用不同劑量的中國對蝦蛋白和弗氏佐劑的混合液腹腔注射誘發(fā)ICR小鼠致敏,采用間接ELISA方法檢測小鼠血清中過敏原特異性IgE和IgG1水平在激發(fā)期不同時間點的變化,并觀察致敏小鼠行為評分,建立動物致敏模型;利用雙向電泳分離蝦蛋白,并與陽性血清免疫印跡,從而通過質譜分析其主要過敏原。結果:3組不同劑量的蝦蛋白浸出液都能使小鼠出現(xiàn)不同程度的過敏癥狀,且劑量越高過敏反應越顯著;其中,高劑量組(1.0 mg)小鼠血清特異性IgE和IgG1抗體含量顯著升高(P0.05),出現(xiàn)瘙癢、嘴角紅腫等現(xiàn)象,過敏癥狀最顯著。通過雙向電泳聯(lián)合質譜鑒定發(fā)現(xiàn),能與陽性血清反應的蛋白有兩種,一種蛋白分子質量為40.2ku,等電點分別為6.0和6.2,經比對為精氨酸激酶;另一種蛋白分子質量為35.8 ku,其等電點為4.6,經比對為原肌球蛋白,通過Mascot數據庫分析比較得到這兩種蛋白質的氨基酸序列。結論:中國對蝦蛋白可引起小鼠過敏反應,其主要過敏原為原肌球蛋白和精氨酸激酶,其中精氨酸激酶可能存在不同蛋白質修飾的兩種形式。
【圖文】：

中國食品學報2017年第12期0.60.50.40.30.2吸光值/OD595nmy=0.5389x+0.2866R2=0.996400.10.20.30.40.5蛋白質量濃度/μg·μL-1圖1中國對蝦蛋白浸出液含量的標準曲線Fig.1Thestandardcurveofshrimpproteinconcentration電泳等多個步驟，之后經過考馬斯亮藍R250染色，用超純水脫色至蛋白點清晰可見，后在成像系統(tǒng)中拍照，通過雙向電泳分析軟件進行蛋白點分析。1.2.6免疫印跡鑒定中國對蝦主要過敏原待雙向電泳結束后，二向膠直接進行Westernblotting。先將與膠等大的PVDF膜浸入100%甲醇中15s，取出膜將凝膠、濾紙一起浸入轉膜緩沖液中平衡10min。在半干式電轉移儀上按照從正極到負極的順序依次放置2層濾紙、PVDF膜、凝膠、2層濾紙，每層均精確對齊并排除氣泡，按15V恒壓轉移2h，電轉移結束后，取出PVDF膜，用PBS-T洗液洗滌數次，加入5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，棄封閉液，用PBS-T洗液洗滌數次，加入適度濃度稀釋的過敏小鼠血清一抗，對照組加入過敏前小鼠血清，4℃下孵育過夜，用PBS-T洗液洗滌數次，加入適度濃度稀釋的HRP標記大鼠抗小鼠IgE二抗，在室溫下孵育2h，用PBS-T洗液洗滌數次，最后在暗室中將ECL發(fā)光A液、B液加到PVDF膜上，進行壓片、顯影、定影，最后在暗格中檢測信號并拍照保存。1.2.7中國對蝦過敏原蛋白質組學研究1.2.7.1酶解主要參考Addis等[6-7]的處理方法進行修改，將差異蛋白點從凝膠上挖出，放入處理過的1.5mLEP管中，用超純水反復沖洗后，進行差異蛋白點膠內酶切。主要步驟為（1）脫色：加入50μL脫色液進行脫色，使蛋白質點由深褐色變成無色透明。用100mmol/L碳酸氫銨沖洗凝膠后，用50%乙腈脫水使其變?yōu)榘咨�，冷凍干燥；�?）酶解：蛋白點溶于50mmol/LNH4HC

第17卷第12期低劑量組對照組543210行為打分71421283542時間/d高劑量組對照組543210行為打分71421283542中劑量組對照組543210行為打分71421283542543210行為打分對照組低劑量組中劑量組高劑量組組別（a）低劑量組（b）中劑量組（c）高劑量組（d）3個劑量組比較圖3中國對蝦蛋白不同劑量組不同激發(fā)期小鼠行為打分Fig.3Thesymptomscoreofsensitizedmiceindifferenttimeperiods注：M：標準分子質量；1：蝦肌肉蛋白樣品。圖2中國對蝦肌肉蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2SDS-PAGEanalysisofshrimpmuscleprotein高的蛋白主要位于32~42ku，約占總蛋白的35%，而中國對蝦的主要過敏原的分子質量也集中在這一范圍，所以通過此裂解液得到的蝦蛋白浸出液效果較好，為后續(xù)ICR小鼠致敏實驗及過敏原鑒定奠定了基矗2.3ICR小鼠致敏模型的建立用提取的蝦蛋白浸出液免疫小鼠使小鼠致敏，經過一個多月飼養(yǎng)后取血處死，在每個時間段進行小鼠過敏行為打分，結果見圖3。處死后得到的血清通過間接ELISA法測定血清中的IgE和IgG1水平，以不同時期為橫坐標，以在490nm和450nm波長下分別測得的吸光值為縱坐標，得到圖4和圖5。在行為打分和IgE、IgG1的表中得到，隨著時間的延長，小鼠行為分數越來越高，說明小鼠致敏效果明顯，且IgE和IgG1水平也逐步呈上升趨勢。由圖3~圖5可見，3種劑量組的致敏效果明顯都比對照組高（P＜0.05），，且隨著劑量的增加，行為分數和IgE、IgG1的水平也越來越高。結果表明，3組不同劑量的蝦蛋白浸出液都能使小鼠致敏，且劑量越高小鼠過敏反應越顯著。時間/d中國對蝦蛋白致敏小鼠模型構建及主要過敏原的雙向電泳聯(lián)合質譜鑒定時間/
【作者單位】： 浙江工商大學食品與生物工程學院浙江省食品安全重點實驗室;
【基金】：國家自然科學基金項目(31571770) 浙江省自然科學基金項目(LY14C200001)
【分類號】：O657.63;TS201.6

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2 胡煒;付強;朱平川;楊麗;劉振方;張明;;用于質譜鑒定蛋白質膠內酶解方法的優(yōu)化[J];南方農業(yè)學報;2011年07期

本文編號：2524508