【摘要】：隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展,人們越發(fā)重視生命體系中的生物分子(核酸、蛋白質(zhì)、酶、小分子等)的分析檢測。人體中的生物分子如與細胞功能和遺傳性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸、與腫瘤和癌癥相關(guān)的標(biāo)志物分子、與人體正常生長發(fā)育相關(guān)生物小分子的出現(xiàn)和變化,預(yù)示著人體正常生理機能的失調(diào)和病變。因而,生命體系中的生物分子的分析檢測對預(yù)防體系病變具有極其重要的意義。近幾年,兼具獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)的碳納米材料如碳納米管、石墨烯、碳納米顆粒等激發(fā)了巨大的研究興趣。因具有良好的光學(xué)性質(zhì)、生物相容性等諸多優(yōu)良性質(zhì),碳納米材料在生命分析領(lǐng)域得到了廣泛而有效地應(yīng)用。碳點作為一種新型碳納米材料,具有成本低、發(fā)射光譜可調(diào)、生物毒性低等諸多優(yōu)勢,構(gòu)建基于碳點的熒光納米探針用于生命分析,逐漸成為分析化學(xué)研究的熱點。然而,碳點基熒光納米探針的構(gòu)建通常需對碳點表面進行修飾或功能化,這一過程繁瑣耗時。并且,目前僅有少部分碳點基熒光納米探針用于生物大分子的檢測。本論文基于利用碳點與目標(biāo)分析物之間的相互作用實現(xiàn)目標(biāo)分析物的檢測的目的。重點利用烏頭酸基碳點與葉酸之間的相互作用發(fā)展了葉酸檢測和靶向癌細胞成像的熒光納米探針;并基于銀離子調(diào)控碳點熒光構(gòu)建了一種納米探針,用于谷胱甘肽還原酶活性評價和抑制劑篩選。全文分為四章:第一章:簡單總結(jié)了碳納米材料的分類及其在生物分析方面的應(yīng)用,進一步簡述了碳點的分類、制備方法、理化性質(zhì)及其在分析化學(xué)方面的應(yīng)用,著重闡述了碳點在生物分析方面的應(yīng)用。第二章:以烏頭酸(aconitic acid,AA)和乙二胺為前驅(qū)體,通過水熱法制備了一種藍色熒光碳點(AA-CDs)。AA-CDs具有良好的水溶性和優(yōu)異的光學(xué)性能,可與葉酸(folic acid,FA)發(fā)生相互作用使其熒光淬滅,基于此建立了FA的定量分析方法,檢測限為40 nM,并成功應(yīng)用于葉酸藥片、燕麥、牛奶、果汁中FA含量的檢測。通過FA和AA-CDs之間的靜電吸引作用構(gòu)建了一種弱熒光納米探針FA-AA-CDs,將其用于葉酸受體(folate receptor,FR)表達程度不同的Hela細胞、SMMC-7721細胞和A549細胞的熒光成像,結(jié)果顯示,細胞熒光亮度與FR表達程度一致,表明該探針可實現(xiàn)靶向癌細胞成像。第三章:以1,2,4-三氨基苯為前驅(qū)體,通過溶劑熱反應(yīng)制備了一種黃色熒光碳點。Ag+離子能夠通過電子轉(zhuǎn)移淬滅該碳點的熒光,而谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)通過NADPH輔助催化還原氧化型谷胱甘肽(glutathione oxide,GSSG)生成還原型谷胱甘肽(glutathione reduced,GSH),GSH能夠競爭結(jié)合Ag+離子,使碳點表面的Ag+離子釋放出來,進而恢復(fù)其熒光。基于上述原理,我們構(gòu)建了一種用于GR活性評價的熒光納米探針,GR檢測限為0.1 mU mL-1。并將其用于監(jiān)測GR抑制劑1,3-二(2-氯乙基)-1亞硝基脲(BCNU)對GR活性的抑制。第四章:在第三章工作基礎(chǔ)上,構(gòu)建了一種谷胱甘肽還原酶抑制劑篩選體系。抑制劑對GR預(yù)處理使其失去活性后,GR無法催化還原GSSG生成GSH使碳點熒光恢復(fù),根據(jù)體系熒光能否恢復(fù)可實現(xiàn)對GR抑制劑的篩選。本工作以已報道的五種抑制劑作為參照,考察了五種含亞硝基、羰基、硫代羰基的化合物對GR活性的影響,實現(xiàn)了GR抑制劑的篩選。
【圖文】：

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 碳點基熒光納米探針的構(gòu)建及其在細胞成像和酶活性評價中的應(yīng)用酸之間的共軛作用，構(gòu)建了葉酸功能化的熒光納米探針，將其用于靶向癌細胞成像[39-42]。然而，碳點的鈍化過程繁瑣耗時，并且鈍化劑會影響葉酸與葉酸受體之間的結(jié)合，進而影響靶向成像。本章工作中，我們以烏頭酸(aconitic acid, AA)為前驅(qū)體，以乙二胺作為共摻雜劑，通過簡單的水熱反應(yīng)制備了一種藍色熒光碳點(AA-CDs)，將 AA-CDs 的絕對量子產(chǎn)率進一步提高至 56.5%。并且，未經(jīng)表面鈍化或修飾的 AA-CDs 能夠與 FA 發(fā)生相互作用，使 AA-CDs 的熒光發(fā)生淬滅。基于此，我們發(fā)展了一種靈敏檢測 FA 的方法。此外，我們由 FA 共軛的 AA-CDs 得到了一種弱熒光探針(FA-AA-CDs)，并以 Hela、SMMC-7721 和 A549 三種葉酸受體表達程度不同的細胞作為模型，考察了 FA-AA-CDs 用于熒光恢復(fù)靶向癌細胞成像的可行性。

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 碳點基熒光納米探針的構(gòu)建及其在細胞成像和酶活性評價中的應(yīng)用條件下的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。首先將在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 48 h 后的細胞稀釋，并接種在放置細胞爬片的 12 孔板上(1 mL/well)，，培養(yǎng) 24 h 后加入 50 μL AA-CDs 或FA-AA-CDs 溶液。此外，加入過量葉 FA 孵育 2 h 后再加入 FA-AA-CDs 溶液孵育 2 h 的 Hela 細胞作為對照實驗考察 FA-AA-CDs 進入細胞的方式。細胞中加入材料孵育一定時間后，用 PBS 緩沖溶液(10 mM, pH 7.4)洗滌三次，并將培養(yǎng)細胞的爬片固定在載玻片上，用奧林巴斯熒光顯微鏡采集細胞成像結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q2-33;O657.3

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本文編號：2517810