【摘要】：三磷酸腺苷(ATP)是生物體內(nèi)一種重要的生物小分子,在許多生命過程中起關(guān)鍵作用。ATP的濃度異常,往往會引發(fā)許多疾病,因此建立簡單快速、靈敏度高、選擇性好的檢測方法不僅對生命過程的基礎(chǔ)研究,而且對臨床診斷,藥物分析等領(lǐng)域也有著十分重要的意義。熒光技術(shù)具有操作簡便,靈敏度高,選擇性好,易于原位成像等優(yōu)點,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的檢測。目前報道的ATP熒光探針,其熒光信號通常基于單波長發(fā)射強度的變化,該方法容易受到外界環(huán)境的影響,信噪比低。而比率型熒光探針,利用探針與底物結(jié)合后,出現(xiàn)激發(fā)或發(fā)射光譜的移位,體系中出現(xiàn)兩個熒光發(fā)射強度隨底物的變化而變化,利用這兩個不同波長處熒光強度的比值而進行的檢測。該方法可以提高檢測的動態(tài)響應(yīng)范圍,建立起內(nèi)標從而極大地削弱其它因素的干擾,是提高熒光探針靈敏度的一個方便而有效的途徑。近年來,基于共軛聚合物的熒光探針因為其良好的光電性質(zhì)和信號放大效應(yīng)受到了廣泛關(guān)注。其中,聚噻吩衍生物由于其構(gòu)象和聚集形態(tài)對外界刺激十分敏感,在分析物的誘導下,其熒光光譜會發(fā)生顯著變化,同時伴隨著溶液顏色的明顯改變,因此作為一種熒光及比色雙模式檢測的探針材料受到眾多科研工作者的追捧。本論文設(shè)計合成了一種比率型ATP熒光探針(Cou-PT),將香豆素熒光團引入到聚噻吩(PT)的側(cè)鏈上,香豆素熒光團作為FRET能量給體,共軛聚噻吩主鏈作為FRET能量受體。其檢測原理如下:未結(jié)合的Cou-PT采用無規(guī)線團構(gòu)象,一旦加入ATP后,Cou-PT與ATP形成復合物,從而導致聚噻吩主鏈從無規(guī)線團構(gòu)象轉(zhuǎn)變成平面構(gòu)象并且發(fā)生鏈間的進一步聚集,體系熒光淬滅,同時紫外光譜明顯紅移。利用加入ATP前后,Cou-PT吸收光譜與香豆素熒光團發(fā)射光譜重疊的變化,來調(diào)控香豆素熒光團到聚噻吩主鏈的FRET效率,偶聯(lián)聚集誘導的熒光淬滅(ACQ)兩種機制,實現(xiàn)對ATP的比率檢測。本論文利用熒光光譜,紫外吸收光譜,圓二色光譜,動態(tài)光散射光譜等分析手段,系統(tǒng)研究了比率探針Cou-PT對ATP的傳感性質(zhì)。研究結(jié)果表明:Job's-plot結(jié)果顯示探針Cou-PT與ATP能形成1:1復合物,結(jié)合常數(shù)為Kapp=3.12×104 M-1,CD光譜和DLS結(jié)果說明ATP的加入使聚噻吩主鏈構(gòu)象發(fā)生了從非平面到平面構(gòu)象的轉(zhuǎn)變并且發(fā)生聚集。Cou-PT在加入ATP前后熒光光譜呈比率變化,同時吸收光譜紅移伴隨溶液顏色變化,所以該探針也可用于裸眼檢測ATP。此外,該探針對ATP表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性,ADP,AMP或各種其他陰離子的加入沒有引起熒光及紫外光譜明顯的變化。Cou-PT還被用于在生理pH條件下實時監(jiān)測ATPase催化的ATP水解反應(yīng),并初步實現(xiàn)了對活細胞的熒光成像。
[Abstract]:Adenosine triphosphate (ATP) is an important biological small molecule in organism, which plays a key role in many life processes. Abnormal concentration of ATP often leads to many diseases, so it is simple, rapid and sensitive. Selective detection methods are of great significance not only for the basic research of life process, but also for clinical diagnosis, drug analysis and so on. Fluorescence technique has been widely used in the detection of bioactive substances because of its advantages of simple operation, high sensitivity, good selectivity and easy in situ imaging. The fluorescence signal of ATP fluorescence probe reported at present is usually based on the change of single wavelength emission intensity. This method is easy to be affected by the external environment and has low signal-to-noise ratio (SNR). However, the ratio fluorescence probe, which combines the substrate with the probe, exhibits excitation or emission shift, and two fluorescence emission intensities change with the change of the substrate. The detection was performed using the ratio of fluorescence intensity at these two different wavelengths. This method can improve the dynamic response range of detection, establish internal standard and greatly weaken the interference of other factors. It is a convenient and effective way to improve the sensitivity of fluorescent probe. In recent years, fluorescent probes based on conjugated polymers have attracted wide attention due to their good photoelectric properties and signal amplification effects. Polythiophene derivatives are sensitive to external stimuli due to their conformation and aggregation morphology. The fluorescence spectra of polythiophene derivatives will change significantly under the inducement of the analyte, and the color of the solution will change obviously. Therefore, as a fluorescence and colorimetric double-mode detection probe materials are sought after by many researchers. In this paper, a ratio ATP fluorescence probe (Cou-PT) was designed and synthesized. Coumarin fluorescence group was introduced into the side chain of polythiophene (PT). Coumarin fluorescence group was used as energy donor for FRET and conjugated polythiophene as FRET energy receptor. The detection principle is as follows: the unbonded Cou-PT adopts the random coil conformation. Once ATP is added, Cou-PT forms a complex with ATP. As a result, the main chain of polythiophene changed from random cluster conformation to plane conformation and further aggregation between chains occurred. The fluorescence quenching of the system and the red shift of UV spectrum were observed. In order to regulate the FRET efficiency of coumarin fluorescence group to the main chain of polythiophene, the Cou-PT absorption spectrum and the emission spectrum of coumarin fluorescence group were overlapped before and after the addition of ATP, and the two mechanisms of fluorescence quenching induced by coupling aggregation of coumarin fluorescence group to polythiophene were also studied. The ratio detection of ATP is realized. In this paper, the sensing properties of ratio probe Cou-PT to ATP were systematically studied by means of fluorescence spectrum, UV absorption spectrum, circular dichroism spectrum and dynamic light scattering spectroscopy. The results of Job's-plot show that Cou-PT and ATP can form 1:1 complex, and the binding constant is Kapp=3.12 脳 104M-1. The CD spectra and DLS results show that the main conformation of polythiophene changes from non-plane to plane conformation and aggregates with the addition of ATP, and the fluorescence spectrum of Cou-PT changes proportionally before and after the addition of ATP. At the same time, the red shift of absorption spectrum is accompanied by the color change of solution, so the probe can also be used for naked eye detection of ATP.. In addition, the probe showed excellent selectivity to ATP, and the addition of ADP,AMP or various other anions did not cause obvious changes in fluorescence and UV spectra. Cou-PT was also used to monitor the hydrolysis of ATP catalyzed by ATPase in real-time under physiological pH conditions. The fluorescence imaging of living cells was preliminarily realized.
【學位授予單位】：天津理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3

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本文編號：2341767