【摘要】：核酸適配體是一種能和靶分子特異性結(jié)合的人工體外合成的單鏈寡核苷酸,其靶分子可以是離子、小分子、蛋白質(zhì)甚至整個細胞。近年來,適配體作為分子識別探針已經(jīng)在醫(yī)療診斷、化學(xué)分析、環(huán)境檢測、食品安全等方面發(fā)揮了重要作用。在基于適配體的分析研究中,凝血酶的兩種適配體是短鏈,合成成本低,而且它們可與凝血酶的不同位點結(jié)合,形成三明治結(jié)構(gòu),同時不影響凝血酶的催化活性,因此凝血酶與其適配體是最常見的研究對象。但是這些研究大多數(shù)都集中在對凝血酶的檢測上。利用適配體對凝血酶的親和力以及凝血酶的催化活性等特點,本文發(fā)展了新型的凝血酶聯(lián)適配體法(TLAA)檢測其他蛋白質(zhì),拓展了凝血酶及其適配體的分析應(yīng)用。構(gòu)建了一條由蛋白質(zhì)目標(biāo)分子適配體序列和凝血酶的適配序列體組成的DNA探針,DNA探針既可與蛋白質(zhì)目標(biāo)分子結(jié)合,也可與凝血酶結(jié)合,通過凝血酶和適配體的直接結(jié)合將凝血酶分子標(biāo)記在蛋白質(zhì)上,從而將蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)化為凝血酶的檢測。凝血酶催化底物產(chǎn)生光學(xué)信號,實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的定量測定。以血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)的檢測為例,分別建立了幾種不同模式的TLAA檢測方法,包括三明治夾心模式的TLAA,滾環(huán)擴增偶聯(lián)的TLAA和競爭模式的TLAA。整個論文包括如下6個章節(jié):第一章:簡要介紹了適配體的篩選和特點,綜述了基于適配體的蛋白質(zhì)檢測方法,闡述了論文的立題背景、主要研究內(nèi)容和創(chuàng)新點。第二章:發(fā)展了一種以磁球為基底的三明治模式TLAA檢測蛋白質(zhì)。DNA探針(由PDGF-BB的適配體、凝血酶的適配體和連接臂三部分組成)和包被在磁球上的抗體分別與PDGF-BB的兩個位點結(jié)合,形成三明治結(jié)構(gòu),凝血酶與DNA探針中凝血酶適配體部分結(jié)合從而標(biāo)記在三明治復(fù)合物上,凝血酶催化熒光底物或生色底物,產(chǎn)生可檢測信號的產(chǎn)物,實現(xiàn)定量測定PDGF-BB。磁球的預(yù)富集作用和凝血酶的催化放大使該方法有較高的靈敏度,使用熒光底物時,檢出限為16 pM。使用生色底物可以進行簡單常見的吸光度分析,同時由于產(chǎn)物有顏色,可以利用反應(yīng)前后溶液顏色的變化進行目測,實現(xiàn)對PDGF-BB的半定量檢測。第三章:發(fā)展了一種以微孔板為基底的三明治模式TLAA檢測蛋白質(zhì)。在上一章工作的基礎(chǔ)上,本論文以微孔板為固體基質(zhì),利用其快速高通量檢測的優(yōu)點,將抗體修飾在微孔板上,隨后依次在微孔板中加入PDGF-BB和DNA探針,形成三明治結(jié)構(gòu)。然后凝血酶被DNA探針捕獲,標(biāo)記在復(fù)合物上。凝血酶催化熒光多肽底物產(chǎn)生熒光信號,信號的強度與PDGF-BB的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。該方法也可用于復(fù)雜樣品中PDGF-BB的檢測。第四章:發(fā)展了滾環(huán)擴增偶聯(lián)的凝血酶聯(lián)適配體檢測方法(RCA-coupled TLAA)。方法利用RCA反應(yīng)產(chǎn)生具有重復(fù)凝血酶適配體序列的寡核苷酸,從而實現(xiàn)多重的凝血酶標(biāo)記,而凝血酶的催化功能則將檢測信號放大,實現(xiàn)了RCA和凝血酶催化的雙重放大效應(yīng),進一步提高了檢測靈敏度。修飾在微孔板上的抗體、PDGF-BB和連有引物的適配體形成三明治結(jié)構(gòu),引物與編碼有凝血酶適配體互補序列的模板雜交,RCA反應(yīng)將引物序列延伸,產(chǎn)生一條含有多重凝血酶適配體的長DNA鏈,RCA產(chǎn)物可以捕獲許多凝血酶分子,在三明治復(fù)合物中實現(xiàn)多重的凝血酶標(biāo)記。凝血酶催化其生色底物或熒光底物產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物,實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量測定。由于RCA和凝血酶催化的雙重放大效應(yīng),檢測的靈敏度得到提高,在使用熒光底物的情況下,方法的檢出限可低至3.1 pM,與單個凝血酶分子標(biāo)記相比,檢出限降低了62倍。第五章:構(gòu)建了競爭模式的TLAA檢測體系。首先PDGF-BB吸附在微孔板表面,然后溶液中的PDGF-BB和固定在微孔板上的PDGF-BB競爭性地與一條包含PDGF-BB適配體和凝血酶適配體的DNA探針結(jié)合,與固定的PDGF-BB結(jié)合的DNA探針捕獲凝血酶分子,最后捕獲的凝血酶催化底物產(chǎn)生熒光信號,進而完成對溶液中PDGF-BB的定量檢測。溶液中的PDGF-BB越多,與固定的PDGF-BB結(jié)合的凝血酶就越少,從而引起熒光信號的下降。方法可以檢測0.125 nM的PDGF-BB,同時實現(xiàn)在1%人血清的檢測。與三明治檢測模式相比,競爭模式的TLAA只需要一個親和探針,縮短了實驗時間。通過簡單改變DNA探針中適配體序列,該方法可以凝血酶為標(biāo)記用于其它物質(zhì)的檢測,擴大了檢測物范圍。第六章:總結(jié)了本文的主要工作和創(chuàng)新點,提出了下一步的工作計劃。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446;O657.3

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本文編號：2338898