發(fā)布時間：2018-11-03 21:55

【摘要】：目的:研究鐵皮石斛中多糖大分子及其衍生物的結(jié)構(gòu)特征與生物活性,為研究鐵皮石斛中基于大分子多糖的生物活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其相關(guān)質(zhì)量控制以及基于石斛多糖創(chuàng)新藥物研究奠定理論與物質(zhì)基礎(chǔ)。方法:本課題采用沸水提-乙醇沉、氫氧化鈉提-乙醇沉的方法獲得鐵皮石斛水提粗多糖以及鐵皮石斛堿提粗多糖。采用酶解法,陰離子交換法以及凝膠過濾色譜法分離純化出均一多糖。采用糖組成分析,部分酸水解、甲基化、紅外、核磁等化學(xué)和物理的方法對多糖性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進行深入解析。采用氯磺酸-吡啶法(1:3)進行多糖的硫酸化衍生。人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)的管腔形成實驗以及劃痕遷移實驗用來考察鐵皮石斛多糖及其硫酸化衍生物的抗血管生成能力。MTT法來檢測鐵皮石斛多糖及其衍生物對不同腫瘤細胞株增殖的抑制作用以及對人正常肝細胞LO2和HMEC-1細胞的毒性。結(jié)果:(1)從1.5 Kg鐵皮石斛干燥莖中得到水提粗多糖DOW 304.0 g(得率為20.3%)和堿提粗多糖DOA 14.0 g(得率為0.9%)。(2)DOW經(jīng)分離純化后得到兩種均一多糖5A以及5B,分子量分別為1.6×104 Da和8.2×103 Da。糖組成分析表明:5A由葡萄糖(glucose,Glc)、甘露糖(mannose,Man)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、半乳糖(galactose,Gal)、木糖(xylose,Xyl)組成,其摩爾比例為55.7:39.7:1.4:0.6:2.6,結(jié)構(gòu)分析表明5A是以1,4-α-D-Glcp、1,4-β-D-Manp為主鏈,支鏈主要包括α和β構(gòu)型的末端(terminal,T)-D-Glcp、T-Xyl以及T-Ara。支鏈連接于主鏈糖殘基1,4-α-D-Glcp的C-6位;5B由Glc、Man和少量的Xyl組成,其摩爾比例為91.9:6.5:1.6,結(jié)構(gòu)分析表明5B是以1,4-α-D-Glcp和極少量的1,4-β-D-Manp為主鏈,支鏈主要包含T-α-D-Glcp,木糖可能存在于支鏈上。支鏈連接于主鏈糖殘基1,4-α-D-Glcp的C-6位。(3)DOA經(jīng)分離純化后得到兩個均一酸性異木聚糖S32和S33S1,分子量分別為3.7×104Da和6.9×103 Da。糖組成分析結(jié)果表明:S32由Ara,Xyl,Glc,Gal,鼠李糖(rhamnose,Rha)和4-甲氧基-葡萄糖醛酸(4-methoxyl-glucuronic acid,4-MGA)組成,各單糖的比例為8.9:62.7:8.5:3.7:3.9:12.3;S33S1糖組成為Xyl,Ara,Glc和4-MGA,比例為6.1:79.8:1.2:12.9。結(jié)構(gòu)分析表明S32和S33S1均是以1,4-β-D-Xylp為主鏈,分支連接于主鏈糖殘基的C-2位。S32的分枝主要由T-4-Me O-α-D-Glc Ap、1,4-α-D-Glcp、1,3-α-L-Rhap、T-α-L-Araf、T-β-D-Galp以及T-β-D-Xylp組成。S33S1的支鏈較簡單,主要包含T-4-Me O-α-D-Glc Ap、T-β-D-Xylp以及T-α-L-Araf。(4)5B和S32經(jīng)硫酸化修飾分別得到S5B和S32S,分子量分別為1.8×104 Da和5.4×104 Da。氯化鋇-明膠法測得二者硫酸基取代度分別為0.92和0.90。結(jié)構(gòu)分析表明前者的硫酸化取代位點主要為1,4-α-D-Glcp和T-α-D-Glcp的C-6位。而后者硫酸化位點主要包括1,4-β-D-Xylp的C-2或者C-3位、少部分的1,2,4-β-D-Xylp的C-3位、T-4-MGA的C-3位以及1,4-α-D-Glcp的C-6位。(5)生物活性測試結(jié)果表明,未硫酸化的多糖5B和S32對HMEC-1細胞的管腔形成幾乎沒有影響,而硫酸化的多糖S5B和S32S均可以在低濃度(5.95μM,0.29μM)時呈現(xiàn)抑制HMEC-1細胞管腔形成和細胞遷移的活性,在較高濃度時1 mg/m L(47.62μM,18.52μM)對人正常的肝細胞LO2以及HMEC-1細胞幾乎沒有毒性。結(jié)論:(1)本課題獲得4種均一多糖。從水提粗多糖中純化出5A和5B;從堿提粗多糖中純化出S32和S33S1。(2)5A和5B主要是以1,4-α-D-Glcp和1,4-β-D-Manp為主鏈的甘葡聚糖;S32和S33S1是以1,4-β-D-Xylp為主鏈的酸性異木聚糖。(3)鐵皮石斛多糖硫酸化衍生物S5B以及S32S具有抗血管生成能力,硫酸基團對生物活性的發(fā)揮有著重要的作用。
[Abstract]:Objective: To study the structural characteristics and biological activities of polysaccharide macromolecules and their derivatives in Dendrobium candidum. METHODS: The crude polysaccharides of Dendrobium candidum and crude polysaccharides of Dendrobium candidum were obtained by boiling water extraction-ethanol precipitation, sodium hydroxide extraction-ethanol precipitation. The polysaccharide was isolated and purified by enzymatic hydrolysis, anion exchange and gel filtration chromatography. The properties and structure of polysaccharides were analyzed by chemical and physical methods such as sugar composition analysis, partial acid hydrolysis, methylation, infrared, nuclear magnetic and other chemical and physical methods. Sulfation of polysaccharides was carried out by chlorosulfonic acid-Fenton method (1: 3). The tube cavity formation experiment and scratch migration experiment of human microvascular endothelial cells (HMEC-1) were used to investigate the anti-angiogenic ability of Dendrobium candidum polysaccharide and sulfated derivatives. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of Dendrobium candidum polysaccharide and its derivatives on the proliferation of different tumor cell lines, as well as the toxicity to human normal hepatocytes LO2 and HMEC-1 cells. Results: (1) The DOW 304. 0g of the crude polysaccharide was obtained from the dried stem of Dendrobium candidum 1. 5Kg (the yield was 20.3%) and the DOA of the crude polysaccharide was 14.0g (the yield was 0. 9%). (2) DOW was isolated and purified to obtain two homogeneous polysaccharides (5A and A21), and their molecular weights were 1. 6, 104 Da and 8. 2, 103 Da, respectively. The composition analysis indicated that 5A was composed of glucose (Glc), mannose (Mannose, Man), arabinose, Ara, galactose, xylose, xylose and Xyl. Its molar ratio was 55. 7: 39. 7: 1. 4: 0. 6: 2.6. The structure analysis showed that 5A was the main chain of 1,4-dioxane-D-Glcp, 1,4-dioxane-D-Manp. The branched chain mainly includes terminal (T)-D-Glcp, T-Xyl, and T-Ara. the branched chain is connected to the C-6 position of the main chain sugar residue 1,4-dioxane-D-Glcp; the branched chain is composed of Glc, Man and a small amount of Xyl, the molar ratio of which is 91.9: 6.5: 1.6, and the structure analysis shows that the branched chain is a main chain of 1,4-dioxane-D-Glcp and a very small amount of 1,4-dioxane-D-Manp, and the branched chain mainly comprises T-MAA-D-Glcp, xylose may be present on the branched chain. The branched chain is connected to the C-6 position of the main chain sugar residue 1,4-dioxane-D-Glcp. (3) The DOA was separated and purified to obtain two homogeneous acidic xylanase S32 and S33S1 with a molecular weight of 3. 7-104Da and 6. 9-0103 Da, respectively. The results of the composition analysis showed that: S32 was composed of Ara, Xyl, Glc, dioxane, nose (rhamnose, Rha) and 4-methoxy-glucononic acid (4-MGA). The ratio of each monosaccharide was 8. 9: 62. 7: 8. 5: 3. 7: 3. 9: 12. 3; S33S1 sugar was composed of Xyl, Ara, Glc and 4-MGA, and the ratio was 6. 1: 79. 8: 1. 2: 12. 9. The structural analysis shows that S32 and S33S1 are the main chains of 1,4-dioxane-D-Xylene, and the branches are connected to the C-2 position of the main chain sugar residue. The branches of S32 are mainly composed of T-4-Me O-A-D-Glc Ap, 1,4-dioxane-D-Glcp, 1,3-dioxane-L-Rhap, T-Et-L-Araf, T-GaP-D-Galp, and T-GaP-D-Xylene. The branched chain of S33S1 is relatively simple, mainly containing T-4-Me O-A-D-Glc Ap, T-Et-D-Xylene and T-Et-L-Araf. (4) S300 and S32S, respectively, were obtained by sulfation modification of quercetin and S32, and the molecular weights were 1. 8 to 104 Da and 5. 4 to 104 Da, respectively. The substitution degree of sulfuric acid was 0.992 and 0.990, respectively. The structural analysis indicated that the former was the C-6 position of 1,4-dioxane-D-Glcp and T-GaP-D-Glcp. The latter mainly consists of the C-2 or C-3 bits of 1,4-dioxane-D-Xylene, the C-3 position of the small part of 1, 2, 4-GaP-D-Xylp, the C-3 position of T-4-MGA, and the C-6 position of 1,4-dioxane-D-Glcp. (5) The results of biological activity test showed that the non-sulfated polysaccharides S300 and S32 had little effect on the tube cavity formation of HMEC-1 cells, but the sulfated polysaccharides S32S and S32S could inhibit the formation of HMEC-1 cell and the activity of cell migration at low concentration (5.95. mu.M, 0. 29. mu.M). At higher concentrations, 1 mg/ m L (47. 62. mu.M, 18. 52. mu.M) had little toxicity to human normal liver cells LO2 and HMEC-1 cells. Conclusion: (1) Four kinds of polysaccharides were obtained in this study. 5A and S33S1 were purified from the crude polysaccharide of water; S32 and S33S1 were purified from the crude polysaccharide. (2) 5A and S33S1 mainly consist of 1,4-dioxane-D-Glcp and 1,4-dioxane-D-Manp as the main chain; S32 and S33S1 are acidic isoxylans with 1,4-dioxane-D-Xylene as the main chain. (3) The sulfated derivatives SS32S and S32S of Dendrobium candidum have anti-angiogenic ability, and sulfuric acid groups play an important role in the biological activity.
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O629.12

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曾萬勇;李金華;王智;楊玉穩(wěn);胡倩;;鐵皮石斛無菌萌發(fā)及小苗快繁培養(yǎng)條件研究[J];武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報;2012年03期

2 聶少平;蔡海蘭;;鐵皮石斛活性成分及其功能研究進展[J];食品科學(xué);2012年23期

3 ;新鮮的鐵皮石斛將凈化鐵皮石斛市場,實實在在的為百姓謀福[J];養(yǎng)生月刊;2006年09期

4 丁鴿;張代臻;張偉超;丁小余;;保健食品鐵皮石斛及其混淆品的分子鑒別及親緣關(guān)系分析[J];食品科學(xué);2011年02期

5 李昊;呂鼎豪;;鐵皮石斛藥用成分研究進展[J];光譜實驗室;2013年04期

6 本刊訊;;養(yǎng)在高山里的鐵皮石斛[J];中國藥學(xué)雜志;2013年19期

7 何伯偉;;浙江鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)品質(zhì)提升的實踐與探索[J];中國藥學(xué)雜志;2013年19期

8 劉亞娟;王詩豪;張銘;華允芬;;鐵皮石斛多糖抗癌及免疫活性研究[J];廣州化工;2014年10期

9 郝梅梅;郝冬冬;;高氧結(jié)合高二氧化碳處理對鐵皮石斛采后品質(zhì)的研究[J];食品科技;2014年08期

10 史永忠,潘瑞熾,王小菁,葉慶生,郭麗榮;鐵皮石斛種質(zhì)資源的低溫離體保存[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;2000年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 諸燕;斯金平;張愛蓮;;人工栽培鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)研究[A];第八屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

2 陳立鉆;倪云霞;孫繼軍;范華芬;許安玲;;鐵皮石斛傳統(tǒng)加工品與機械加工品的多糖含量對比研究[A];全國第六屆天然藥物資源學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

3 郭英英;劉京晶;斯金平;;雁蕩山不同樹種活樹附生鐵皮石斛多糖含量差異比較[A];生態(tài)文明建設(shè)中的植物學(xué)：現(xiàn)在與未來——中國植物學(xué)會第十五屆會員代表大會暨八十周年學(xué)術(shù)年會論文集——第4分會場：資源植物學(xué)[C];2013年

4 王伯初;李標(biāo);;響應(yīng)聲波加載的鐵皮石斛差異表達基因篩選及其功能初步研究[A];2008年全國生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2008年

5 丁小余;侯北偉;謝明璐;;珍稀鐵皮石斛基于微衛(wèi)星標(biāo)記的種質(zhì)鑒別與保護遺傳學(xué)研究[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

6 朱波;斯金平;苑鶴;;鐵皮石斛雜交育種的初步研究[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

7 李宏博;張宏宇;樸鐘云;;鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 斯金平;;鐵皮石斛可持續(xù)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)研究進展[A];第十屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

9 金璐英;斯金平;張愛蓮;魏濤;莫伊娜;;鐵皮石斛中基本氨基酸含量變異規(guī)律[A];第十屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

10 張治國;劉驊;夏志俊;王君暉;黃純農(nóng);;鐵皮石斛種子的超低溫保存[A];中國植物生理學(xué)會全國學(xué)術(shù)年會暨成立40周年慶祝大會學(xué)術(shù)論文摘要匯編[C];2003年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者 王晶晶;鐵皮石斛扎根浙江[N];中國經(jīng)濟導(dǎo)報;2006年

2 施仁潮;鐵皮石斛研究成果驗收[N];科技日報;2006年

3 張文聰;做大鐵皮石斛種植業(yè) 幫助群眾走上致富路[N];韶關(guān)日報;2007年

4 本報記者 何潭振 戴正聰;讓所有老百姓都能吃得起鐵皮石斛[N];中國食品質(zhì)量報;2006年

5 本報記者　 王蔚佳;鐵皮石斛神話如何延續(xù)[N];中國醫(yī)藥報;2006年

6 施文;浙江將出臺鐵皮石斛品種標(biāo)準(zhǔn)[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

7 本報記者 施仁潮;他讓瀕危中藥鐵皮石斛重獲新生[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

8 中華中醫(yī)藥學(xué)會 莊乾竹;寶寶能喝鐵皮石斛水嗎？[N];健康時報;2008年

9 王英;“工廠”里種出鐵皮石斛[N];蘇州日報;2008年

10 收集整理 軍野;鐵皮石斛的文化淵源[N];世界報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孫婧;鐵皮石斛提取物及其活性成分毛蘭素對人乳腺癌細胞抑制作用的研究[D];吉林大學(xué);2016年

2 梁楚燕;基于衰老雌鼠模型探討鐵皮石斛“補腎”功效的科學(xué)內(nèi)涵[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

3 徐程;鐵皮石斛種質(zhì)資源與組培工廠化生產(chǎn)研究[D];浙江大學(xué);2006年

4 包英華;鐵皮石斛種質(zhì)資源的鑒定與評價研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

5 嚴(yán)亮;中國傳統(tǒng)蘭科藥用植物鐵皮石斛基因組及其生物學(xué)特性研究[D];吉林大學(xué);2014年

6 張澤錦;鐵皮石斛的光合碳同化途徑及其對環(huán)境變化的生理響應(yīng)[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 趙興兵;超微鐵皮石斛對脾虛便秘小鼠腸道微生物的影響研究[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2014年

8 李標(biāo);聲波刺激對鐵皮石斛生長代謝的影響及其相關(guān)基因表達和克隆研究[D];重慶大學(xué);2007年

9 滕建北;鐵皮石斛與美花石斛莖尖生長機理及其多糖累積規(guī)律研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2009年

10 關(guān)杰敏;鐵皮石斛良種繁育與GAP種植關(guān)鍵技術(shù)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 諸燕;鐵皮石斛種質(zhì)資源收集與評價[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2010年

2 辛甜;組培鐵皮石斛的品質(zhì)評價研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2011年

3 戴燕萍;鐵皮石斛生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2012年

4 王俊潔;鐵皮石斛體細胞無性變異的生藥學(xué)初步研究[D];云南中醫(yī)學(xué)院;2012年

5 李東賓;冷脅迫下鐵皮石斛抗寒基因的克隆與表達研究[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2013年

6 馮云;鐵皮石斛儲藏與加工特性研究[D];華南理工大學(xué);2015年

7 鄧星燕;鐵皮石斛紫外指紋圖譜研究[D];云南民族大學(xué);2015年

8 朱夢麗;鐵皮石斛甘露糖結(jié)合凝集素的分子建模與對接研究，及NAC基因組序列的克隆[D];西南交通大學(xué);2015年

9 陳爾;鐵皮石斛組培快繁技術(shù)的優(yōu)化[D];中南林業(yè)科技大學(xué);2015年

10 任潔;鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)及叢生芽增殖體系的建立[D];南京師范大學(xué);2015年

，

本文編號：2309153