【摘要】：微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源的、長度約為18～25nt的短鏈非編碼RNA。miRNA具有基因調(diào)控作用,其表達水平異常往往與疾病的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,miRNA被視為一類新型的生物標記物。此外,病毒核酸非編碼區(qū)域含有高度保守性的核酸序列,該保守核酸序列在病毒變異過程中能夠保持不變。因此,無論是miRNA,還是病毒核酸保守序列,對其進行檢測,在相關(guān)疾病的早期診斷和預(yù)測方面具有重要性意義。金屬有機骨架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)是由無機金屬離子和有機配體配位自組裝構(gòu)筑形成的新型無機有機雜化材料。2013年,Chen等首次報道具有良好水穩(wěn)定性的MOFs可與熒光標記的探針DNA(probe DNA,P-DNA)結(jié)合構(gòu)筑P-DNA@MOF傳感平臺,用于熒光檢測核酸分子。但是,MOFs用十核酸分子檢測仍處在起步階段,只有為數(shù)不多的MOFs被成功用于檢測DNA/RNA,主要是因為大多數(shù)合成的MOFs對水不穩(wěn)定。因此,構(gòu)建具有水穩(wěn)定性的MOFs結(jié)構(gòu),并從中篩選出能夠靈敏特異性檢測疾病相關(guān)的核酸分子對疾病的檢測具有重要的意義。近年來,本課題組一直致力于設(shè)計并合成結(jié)構(gòu)新穎、且具有良好水穩(wěn)定性的MOFs及其生物性能研究。含亞甲基的季銨鹽型多羧酸配體與金屬離子構(gòu)筑的MOFs具有良好水穩(wěn)定性,可避免其在核酸分子檢測中結(jié)構(gòu)坍塌而導(dǎo)致檢測失敗。本論文研究了該類MOFs與熒光標記的探針DNA構(gòu)筑P-DNA@MOF傳感平臺及其對疾病相關(guān)的RNA序列檢測的性能:一、應(yīng)用三維 MOF {[Cu(Cmdcp)(phen)(H20)]2·9H2O}5(1)分別與 FAM 熒光標記的P-DNA-1和ROX熒光標記的P-DNA-2結(jié)合構(gòu)筑P-DNA-1@1和P-DNA-2@1傳感平臺,并成功用于熒光檢測EBOV的保守序列片段(T1)及該病毒編碼的類miRNA(T2)。其中,MOF 1對P-DNA-1和P-DNA-2的淬滅率分別為75%和95%;對Ti和T2的檢測時間分別為12.5 min和3.2min,檢測限分別為63 pM和206 pM。為了克服操作繁瑣、費時費力的缺點,進一步將P-DNA-1和P-DNA-2同時與MOF 1結(jié)合構(gòu)筑P-DNAs@1傳感平臺,并結(jié)合恒波長同步熒光檢測法同時對Ti和T2進行熒光檢測。雖然MOF 1對T1和T2的同步檢測與單獨檢測活性相當,但是同步檢測可以簡稱檢測過程,節(jié)約檢測時間。二、MOFs與P-DNA主要通過π-π堆積、靜電以及氫鍵等作用力結(jié)合,增加MOFs結(jié)構(gòu)中的π體系有利于MOFs更有效的與P-DNA結(jié)合。因此,我們通過引入稠環(huán)配體bipy(bipy=4,4'-bipyridine)和具有更大稠環(huán)體系的季銨鹽羧酸 Dcbb(Dcbb= 1-(3,5-dicarboxybenzyl)-4,4'-bipyridiniumbromide)共同構(gòu)建了二維MOF[Cu(dcbb)(bipy)(H2O)]n(2),并將其用于同步熒光檢測ZIKV非編碼區(qū)的3段保守序列片段T3、T4和T5。研究表明,MOF2對分別為FAM、ROX和Cy5熒光標記的P-DNA-4、P-DNA-5和P-DNA-6均具有良好的熒光淬滅性能,熒光淬滅率分別為88%、96%和80%,并且所構(gòu)筑的P-DNAs@2能夠高靈敏、高選擇性地同步熒光檢測T3、T4和T5,檢測時間分別為12 min、2.3 min和3 min,檢測限分別為564 pM、158 pM和186 pM。三、為了考察P-DNA@MOF傳感平臺的實用價值,我們將檢測對象由病毒核酸非編碼區(qū)的保守序列轉(zhuǎn)為疾病相關(guān)的且表達異常的miRNA。采用課題組前期合成的一維MOF {[Cu(Dcbb)2(H2O)2]·10H2O}n(3)構(gòu)建傳感平臺,用于熒光檢測與胃癌相關(guān)的5種miRNA。由于目前仍未尋找到適用于同步熒光檢測的5 種熒光標記物,因此,我們對與 miR-185(T6)、miR-20a(T7)、miR-92b(T8)、miR-25(T9)以及miR-210(T10)互補的5種DNA均進行FAM熒光標記,并分別與MOF 3結(jié)合構(gòu)筑P-DNA-6@3～P-DNA-10@3傳感平臺,淬滅率分別為87%、94%、77%、95%以及 96%。P-DNA-6@3～P-DNA-10@3 分別對 T6～T10 逐個進行熒光檢測,檢測時間分別為13 min、14 min、15 min、19 min以及38 min;檢測限分別為172pM、321pM、91pM、559 pM以及132pM。本實驗研究初步證明以MOFs構(gòu)建的傳感平臺對多種miRNA檢測的可行性。四、為了進一步研究MOFs構(gòu)建的傳感平臺在細胞水平上對miRNA的檢測性能,我們采用了對核酸酶穩(wěn)定且對其靶向RNA的親和力較普通核酸強的2'OMe-PSchimera(簡稱mDNA)來構(gòu)建傳感平臺。我們采用FAM、TAMRA和Cy5分別對3種mDNA進行熒光標記得到P-mDNAs,并與三維的MOF{[Cu2(Cmdcp)2(bipy)(H2O)2]0.5H2O}n(4)同時結(jié)合構(gòu)筑熒光傳感平臺P-mDNAs@4用于同步熒光檢測與口腔癌相關(guān)的miR-21、miR-155和miR-375。其中MOF 4對P-m21、P-m155和P-m375的熒光淬滅率分別為89%、94%和87%;對T21、T155和T375的檢測時間分別為5.3min、1.9min和1.5min;檢測限分別為 229pM、64pM 和 385 pM。與 P-DNAs@4 傳感平臺(對 T21、T155 和 T375 的檢測時間分別為13 min、3.4 min和2.6 min;檢測限分別為750 pM、445 pM和629 pM)相比較,P-mDNAs@4對靶向miRNA的檢測更為快速和靈敏。在此基礎(chǔ)上,我們進一步將P-mDNA@4導(dǎo)入UM1、HSC3和SCC9這3種口腔癌細胞并成功地檢測胞內(nèi)高表達的miR-21、miR-155,而對低表達的miR-375沒有顯示檢測效果。上述熒光檢測中,MOF 1-4分別構(gòu)筑的熒光傳感平臺均能快速、靈敏、高選擇性地檢測相應(yīng)的靶向RNA。我們還進一步通過結(jié)合常數(shù)的計算、熒光各向異性實驗和PAGE凝膠電泳實驗初步闡述了 MOFs檢測核酸分子的檢測機理。
[Abstract]:In recent years , MOFs with good water stability have been successfully used to detect DNA / RNA . In recent years , MOFs with good water stability have been successfully used to detect DNA / RNA . In order to further study the feasibility of using MOFs to detect miRNA , the detection limits were respectively 172pM , 321pM , 91pM , 55pM and 132pM . The detection limits were respectively 172pM , 321pM , 91pM , 559 pM and 132pM . The detection limits were respectively : On this basis , we further introduced three kinds of oral cancer cells , such as UM1 , HSC3 and SCC9 , and successfully detected miR - 21 , miR - 155 with high expression of miR - 21 and miR - 155 .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3;R440

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本文編號：2118783