本文選題：熒光各向異性 + 氧化石墨烯��； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：近年來,熒光各向異性法被廣泛用于生化分析及臨床診斷中。熒光各向異性值與分子的體積和質(zhì)量相關(guān)。由于多數(shù)分子的體積和質(zhì)量相對(duì)較小,能引起的熒光各向異性變化非常微弱,因此檢測靈敏度有待提高。納米材料已經(jīng)成功用于放大熒光各向異性信號(hào),其中,氧化石墨烯相比于零維的球形納米顆粒具有更大的比表面積和在溶液中更低的旋轉(zhuǎn)速率,并且能特異性識(shí)別核酸單雙鏈,因而成為優(yōu)良的熒光各向異性信號(hào)增強(qiáng)劑。然而,氧化石墨烯增強(qiáng)熒光各向異性存在一定局限,一方面氧化石墨烯對(duì)熒光染料的熒光存在較大的猝滅作用,從而影響檢測的準(zhǔn)確度;另一方面若探針分子直接吸附在氧化石墨烯表面,加入靶物后,探針分子不易從氧化石墨烯上釋放出來,從而影響檢測靈敏度。鑒于此,本論文設(shè)計(jì)了新型氧化石墨烯增強(qiáng)熒光各向異性方法,并且結(jié)合信號(hào)放大策略,實(shí)現(xiàn)了一系列生物分子的分析檢測。具體研究內(nèi)容包括以下三個(gè)方面:(1)設(shè)計(jì)了一種新型、通用、具有更高準(zhǔn)確度和靈敏度的氧化石墨烯增強(qiáng)熒光各向異性策略。在本設(shè)計(jì)中,探針分子通過捕獲DNA間接固定在氧化石墨烯上,從而增大了探針分子上熒光染料的熒光各向異性,加入靶物之后,探針分子從氧化石墨烯上釋放出來,熒光各向異性值減小,通過測定加入靶物前后熒光各向異性值的變化實(shí)現(xiàn)了對(duì)單鏈DNA、腺苷和凝血酶的靈敏檢測。該方法通過引進(jìn)捕獲DNA,降低了氧化石墨烯對(duì)熒光染料熒光的猝滅,從而提高了檢測準(zhǔn)確度;并且使熒光探針分子更易從氧化石墨烯上釋放,提高了檢測靈敏度。(2)基于以上策略,進(jìn)一步開發(fā)了核酸外切酶III輔助氧化石墨烯放大熒光各向異性信號(hào)方法,并用于蓖麻毒素B鏈的靈敏檢測。該方法以核酸適配體作為識(shí)別單元,與傳統(tǒng)的免疫檢測蓖麻毒素方法比較具有簡單、快速,成本低等優(yōu)點(diǎn)。此外,我們使用核酸外切酶III實(shí)現(xiàn)了循環(huán)放大信號(hào),進(jìn)一步提高了檢測靈敏度。在該設(shè)計(jì)中,蓖麻毒素B鏈的核酸適配體和blocker序列部分雜交并且和磁珠相連,加入蓖麻毒素B鏈后,blocker從磁珠表面釋放。游離的blocker能引起鏈置換反應(yīng)和探針DNA雜交形成雙鏈,從而使探針DNA從氧化石墨烯上釋放,熒光各向異性降低。釋放后的blocker-探針DNA雙鏈在核酸外切酶III的作用下實(shí)現(xiàn)循環(huán)放大信號(hào),即一個(gè)blocker鏈通過循環(huán)作用,可以消耗大量的探針DNA,使得熒光各向異性大大減小。通過降低的熒光各向異性信號(hào)實(shí)現(xiàn)了蓖麻毒素B鏈的靈敏檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熒光各向異性變化值和蓖麻毒素B鏈在濃度為1.0μg/mL 13.3μg/m L間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測限為400 ng/mL。該檢測限接近目前發(fā)展的免疫方法,比不使用核酸外切酶III時(shí)低22.5倍。通過改變相應(yīng)的核酸適配體序列該方法還可實(shí)現(xiàn)檢測其他靶物。(3)利用無酶放大信號(hào)方法(靶物催化DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)組裝,CHA)輔助氧化石墨烯增強(qiáng)熒光各向異性建立了具有高靈敏度和高選擇性的microRNA-21檢測方案。探針DNA通過捕獲DNA與氧化石墨烯間接相連,使其熒光各向異性增大。加入microRNA-21后,引發(fā)DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)組裝,形成無酶循環(huán)反應(yīng)。同時(shí),發(fā)卡結(jié)構(gòu)組裝體能通過鏈置換反應(yīng)與探針DNA組成復(fù)合體,并使探針DNA從氧化石墨烯上釋放,導(dǎo)致熒光各向異性值降低。通過降低的熒光各向異性信號(hào)實(shí)現(xiàn)了microRNA-21的靈敏檢測。熒光各向異性降低值和microRNA-21在濃度為0.1nM-16 nM間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測限為47 pM。該檢測限比不使用CHA時(shí)低279倍。此外,與不使用CHA比較,該檢測方法的選擇性得到了明顯提高。該方法實(shí)現(xiàn)了無酶循環(huán)放大信號(hào),提高了檢測靈敏度和選擇性,克服了蛋白質(zhì)酶放大信號(hào)的穩(wěn)定性低、成本高等局限,并且完成了癌細(xì)胞內(nèi)microRNA-21的靈敏檢測,為臨床診斷提供了一種快速簡單的方法。綜上所述,在本研究中,我們提出了新型氧化石墨烯增強(qiáng)熒光各向異性策略,該策略己成功應(yīng)用到一系列生物分子(核酸、蛋白質(zhì)、腺苷)的分析檢測中,提高了氧化石墨烯增強(qiáng)熒光各向異性檢測方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。同時(shí),我們結(jié)合循環(huán)放大信號(hào)策略,進(jìn)一步提高了熒光各向異性檢測方法的靈敏度和選擇性,為危險(xiǎn)品檢測和疾病診斷提供了簡單快速的方法。這些方法還具有普適性,通過適當(dāng)替換探針,便能夠應(yīng)用于其他靶物的分析中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O657.3

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本文編號(hào)：1955098