本文關(guān)鍵詞：熒光探針法和疏水相互作用層析法分析蛋白表面疏水性，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《浙江大學(xué)》 2014年

熒光探針法和疏水相互作用層析法分析蛋白表面疏水性

余晶梅  

【摘要】：蛋白表面疏水性是蛋白質(zhì)的重要特性之一,對(duì)于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定構(gòu)象及生物活性有著重要作用,同時(shí)又是疏水作用為主的層析分離蛋白質(zhì)方法的重要依據(jù)。了解蛋白質(zhì)在不同條件下表面疏水特性的變化,有助于理解其結(jié)構(gòu)變化和生理活性,對(duì)于優(yōu)化蛋白分離過程也有指導(dǎo)意義。本文利用熒光探針法和疏水相互作用層析(HIC)法,探究不同因素對(duì)蛋白表面疏水性的影響,得到一些規(guī)律性認(rèn)識(shí)。主要結(jié)果如下： 首先以8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽(ANS)為熒光探針,優(yōu)選了測(cè)定體系的pH值和ANS濃度,測(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)S0,考察了溫度、鹽、變性劑、辛酸鈉(NaCA)等對(duì)牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG) So的影響。發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)BSA和bIgG表面疏水性的影響呈現(xiàn)相反的規(guī)律。不同鹽對(duì)蛋白表面疏水性的影響與相關(guān)離子的Hofmeister序列位置相關(guān),穩(wěn)液鹽和中性鹽存在時(shí)蛋白質(zhì)的S0值大于離液鹽條件下的S0值。BSA和bIgG的表面疏水性受十二烷基磺酸鈉(SDS)的影響存在較大差異。鹽酸胍濃度升高,BSA的S0值明顯減小,而bIgG的S0值先增大后減小。NaCA濃度提高,BSA的S0值逐漸減小,而bIgG的S0值則幾乎沒有變化。 運(yùn)用熒光光譜法進(jìn)一步分析熒光探針-蛋白質(zhì)的結(jié)合作用,比較多種數(shù)據(jù)處理方法。結(jié)果表明,Scatchard非線性方程適合分析BSA-ANS及IgG-ANS體系,獲得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為5.8和10.7,結(jié)合常數(shù)分別為3.37×106M-1和3.34×104M-1。利用Adair公式分析BSA-ANS體系,不僅獲得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)5,還可得到各位點(diǎn)相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)。 采用疏水相互作用層析法,以Phenyl Sepharose6FF為層析介質(zhì),選取牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG)和溶菌酶為模型蛋白,測(cè)定不同條件下蛋白的容量因子k',表征蛋白的表面疏水性變化。發(fā)現(xiàn)三種蛋白質(zhì)的lnk'隨著(NH4)2SO4和NaCl濃度升高而增大,隨NaSCN濃度增大而減小�；趦�(yōu)先相互作用理論計(jì)算得到的三種蛋白質(zhì)在穩(wěn)液鹽(NH4)2SO4和中性鹽NaCl存在時(shí)的水分子釋放數(shù)為正值,而離液鹽NaSCN條件下,水分子釋放數(shù)為負(fù)值。相同濃度Na2SO4、(NH4)2SO4NaCl、 NH4Cl及NaSCN溶液,BSA和bIgG對(duì)應(yīng)的k’依次減小。pH在3-8范圍內(nèi),對(duì)于BSA和溶菌酶,pH值越接近等電點(diǎn),k’值越大,而bIgG的k’值則隨pH的升高而增大。三種蛋白質(zhì)的k’值受鹽酸胍濃度影響的整體趨勢(shì)相同,均隨鹽酸胍濃度的升高而減小。辛酸鈉濃度從0升高至75mM, BSA的k’值先減小后增大,而bIgG的k’值則保持在1.7左右。隨著乙醇添加量的增大,三種蛋白質(zhì)的k’值均不斷減小。 比較熒光探針法測(cè)定的S0和疏水相互作用層析法測(cè)得的k’,發(fā)現(xiàn)二者具有較好的相關(guān)性。不同NaCl、(NH4)2SO4濃度以及不同鹽類存在時(shí),BSA和bIgG的S0能與容量因子較好地對(duì)應(yīng)。BSA的S0隨鹽酸胍濃度的變化情況與k’值的變化一致。保持辛酸鈉/蛋白質(zhì)的濃度比相同,熒光探針法測(cè)得的辛酸鈉濃度0～4.5mM范圍內(nèi)的S0值與辛酸鈉濃度為0～50mM時(shí)BSA的k’值變化規(guī)律相同。結(jié)果表明,熒光探針測(cè)定的蛋白質(zhì)在不同溶液中的表面疏水性指數(shù)在一定程度上可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在疏水層析柱上的保留行為。 本文利用熒光探針法和疏水相互作用層析法考察了不同因素對(duì)蛋白表面疏水性的影響,得到了一些規(guī)律性的認(rèn)識(shí)。一方面充分了解蛋白質(zhì)的表面疏水特性,有助于提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,為蛋白質(zhì)的貯存和配方優(yōu)化提供指導(dǎo)；另一方面,對(duì)于疏水結(jié)合起主導(dǎo)作用的疏水相互作用層析和疏水性電荷誘導(dǎo)層析等蛋白分離過程,表面疏水性信息有助于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保留行為,改善分離過程,提高分離效率。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：O647
【目錄】：

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本文編號(hào)：192978