本文選題：脂肪酶 + 工業(yè)應(yīng)用��； 參考：《華南理工大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：脂肪酶是一類可以催化脂類水解反應(yīng)的酶,由于具有較好的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性,因此在食品加工、制藥、以及化工領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用。脂肪酶可以催化烯烴的環(huán)氧化反應(yīng),近年來利用脂肪酶催化合成各種環(huán)氧化物已成為研究熱點(diǎn),但脂肪酶催化烯烴環(huán)氧化反應(yīng)的機(jī)理至今還未闡述清楚。本論文選取來自卡門柏青霉菌的脂肪酶PCL作為研究對(duì)象,通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究以及分子對(duì)接研究,對(duì)PCL催化烯烴環(huán)氧化反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了探討。主要研究結(jié)果如下:1.脂肪酶PCL及其突變體的克隆表達(dá)與純化:合成了脂肪酶PCL的全長基因,構(gòu)建了活性中心催化三聯(lián)體的突變體S145A和H259A,在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)高效重組表達(dá),并通過陰離子交換層析純化,獲得純度較高的蛋白。2.脂肪酶PCL及其突變體催化烯烴環(huán)氧化反應(yīng)的研究:PCL對(duì)油酸和1-十八烯都具有較高的環(huán)氧化活力;與PCL相比,S145A對(duì)兩種底物的活力都較低,但仍保留一定的環(huán)氧化活力;H259A完全沒有環(huán)氧化活力。通過電噴霧電離質(zhì)譜分析環(huán)氧化反應(yīng)過程中生成的物質(zhì),發(fā)現(xiàn)PCL和S145A催化烯烴的環(huán)氧化反應(yīng)都是酶法-化學(xué)過程,首先酶催化羧酸的過氧水解反應(yīng)產(chǎn)生過氧酸,過氧酸釋放后再自發(fā)把烯烴環(huán)氧化。研究發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)PCL的環(huán)氧化活力影響不大,而S145A的活力對(duì)pH值十分敏感;與PCL相比,S145A的環(huán)氧化活力對(duì)過氧化氫的濃度更具有依賴性。3.脂肪酶PCL的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究:通過蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn),獲得高分辨率的PCL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),并上傳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB ID:5CH8)。通過計(jì)算機(jī)模擬對(duì)PCL與底物進(jìn)行分子對(duì)接,得到脂肪酶PCL-過氧化氫-辛酸復(fù)合結(jié)構(gòu)模型。4.脂肪酶PCL催化烯烴環(huán)氧化反應(yīng)機(jī)理的研究:綜合分析生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)構(gòu)模型,提出脂肪酶催化產(chǎn)生過氧酸的反應(yīng)由兩種機(jī)理協(xié)同作用,一個(gè)是經(jīng)典的通過活性中心絲氨酸Ser145形成酰酶復(fù)合物的機(jī)理,另一個(gè)是本研究提出和證明的、由活性中心組氨酸His259主導(dǎo)的機(jī)理。His259是PCL發(fā)揮環(huán)氧化活力的關(guān)鍵氨基酸,在兩種反應(yīng)機(jī)理中分別奪取Ser145或過氧化氫的質(zhì)子產(chǎn)生反應(yīng)。Ser145雖然不是酶分子發(fā)揮活力的必要氨基酸,但可以顯著地提高脂肪酶PCL的環(huán)氧化活力。本論文通過生化實(shí)驗(yàn)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和分子對(duì)接研究,提出了在分子水平上卡門柏青霉菌脂肪酶PCL催化烯烴環(huán)氧化反應(yīng)的機(jī)理,對(duì)今后改造、篩選具有應(yīng)用前景的環(huán)氧化工業(yè)用酶具有重要意義。
[Abstract]:Lipase is a kind of enzyme which can catalyze the hydrolysis of lipids. Because of its good thermal stability and solvent tolerance, lipase has been widely used in food processing, pharmaceutical industry and chemical industry. Lipase can catalyze the epoxidation of olefin. In recent years, the synthesis of various epoxides catalyzed by lipase has become a hot topic, but the mechanism of lipase-catalyzed epoxidation of olefin has not been elucidated. In this paper, the lipase PCL from Penicillium Carmensi was selected as the research object. The mechanism of the epoxidation of olefins catalyzed by PCL was studied by biochemical experiments, protein structure studies and molecular docking studies. The main results are as follows: 1. Cloning, expression and purification of lipase PCL and its mutants: the full-length lipase PCL gene was synthesized, and the active center catalytic triad mutants S145A and H259A were constructed, which were highly expressed in Pichia pastoris. The purified protein was purified by anion exchange chromatography. Studies on the Epoxidation of olefin catalyzed by Lipase PCL and its Mutants; the epoxidation activity of PCL to oleic acid and 1-octadecene is higher than that of PCL, and the activity of S145A to both substrates is lower than that of PCL. However, there is no epoxidation activity at all in H 259A. By electrospray ionization mass spectrometry, it was found that the epoxidation of olefin catalyzed by PCL and S145A was an enzymatic chemical process. Firstly, peroxy hydrolysis of carboxylic acid was catalyzed by enzyme to produce peroxic acid. Peroxic acid released and then spontaneously epoxidation of olefins. It was found that pH value had little effect on the epoxidation activity of PCL, while the activity of S145A was sensitive to pH value, and that the epoxidation activity of S145A was more dependent on the concentration of hydrogen peroxide than that of PCL. Studies on structural biology of lipase PCL: high resolution PCL protein structure was obtained by protein crystallization experiment, and the protein structure database was uploaded. The compound structure model of lipase PCL- hydrogen peroxide-octanoic acid was obtained by molecular docking of PCL with substrate by computer simulation. Studies on the Mechanism of Lipase PCL catalyzed Epoxidation of Olefins: the results of biochemical experiments and the structural model were comprehensively analyzed, and the synergistic effect of the two mechanisms for lipase catalyzed peroxic acid production was put forward. One is the classical mechanism for the formation of acylase complexes through the active center serine Ser145, the other is the mechanism proposed and proved in this study. His259 is the key amino acid of PCL to exert its epoxidation activity, which is dominated by the active central histidine His259. The proton production reaction of Ser145 or hydrogen peroxide. Ser145 is not a necessary amino acid for enzyme molecule to exert its activity, but it can significantly increase the epoxidation activity of lipase PCL. In this paper, the mechanism of olefin epoxidation catalyzed by penicillium Carmenella lipase PCL at molecular level was proposed through biochemical experiments, structural biology studies and molecular docking studies. It is of great significance to screen the enzymes used in epoxide industry.
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O621.251

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本文編號(hào)：1928106