本文選題：解旋酶 + 生物傳感平臺�。� 參考：《太原理工大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目前,分子診斷生物學(xué)研究正不斷地對人類疾病診斷產(chǎn)生變革性的影響,它可以幫助醫(yī)生更好地了解每個病人的臨床狀況,如當(dāng)前疾病狀態(tài)、預(yù)測疾病狀態(tài)、藥物反應(yīng)和治療預(yù)后。分子診斷的本質(zhì)在于靈敏檢測疾病生物標(biāo)志物,如蛋白質(zhì)、碳水化合物或核酸。MicroRNAs(miRs)作為一組內(nèi)源性非編碼RNA(18-25核苷酸),在多種疾病細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的作用。值得注意的是,miRs的頻繁異常表達(dá)將這些小細(xì)胞分子成分加入到癌癥的潛在生物標(biāo)志物行列。因此,敏感和有效的檢測方法對于更好地理解這些相對較小的核酸分子和進(jìn)一步驗(yàn)證其在臨床分子診斷中的功能具有重要的意義。然而,由于它們具有小尺寸和高度同源等特性,敏感和經(jīng)濟(jì)的miRs檢測方法仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。近年來,各種以檢測靈敏度和特異性為研究重點(diǎn)的新方法處于不斷開發(fā)中,如納米顆粒復(fù)合探針、等溫擴(kuò)增方法和電化學(xué)方法等。其中,大部分等溫擴(kuò)增方法所依靠的鏈置換、鏈雜交和鏈延伸等循環(huán)擴(kuò)增原理都與核酸酶密切相關(guān),如聚合酶、核酸內(nèi)切酶或切口酶、雙鏈特異性核酸酶等。解旋酶是一類重要的核酸酶,它可以利用ATP水解的能量沿著核酸磷酸骨架定向移動,分離兩條退火的核酸鏈(即dna鏈、rna鏈或rna-dna雜交鏈)。解旋酶對核酸分子探針內(nèi)氫鍵的水解活性,使其在相應(yīng)的分子診斷系統(tǒng)中具有巨大的潛在應(yīng)用性,特別是以雜交反應(yīng)為檢測原理的傳感系統(tǒng)。本文通過pet24a-recqe重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)獲得大腸桿菌recq解旋酶(recqe),系統(tǒng)研究了recqe在不同mir氧化石墨烯(go)傳感平臺中的作用機(jī)理以及酶學(xué)活性。分析了recqe在以1:1雜交反應(yīng)以及雜交鏈反應(yīng)(hcr)為檢測原理的傳感平臺中的分子作用機(jī)制,構(gòu)建了recqe輔助go傳感平臺和高靈敏recqe酶促hcr/go傳感平臺,并對這兩個傳感平臺做了進(jìn)一步的研究,主要內(nèi)容如下:(1)開發(fā)了一種以1:1雜交反應(yīng)為檢測原理的recqe酶輔助go傳感平臺,用于系統(tǒng)的研究解旋酶對傳感平臺中雜交反應(yīng)的分子作用機(jī)制。此傳感平臺通過簡單的dna/rna雜交反應(yīng),實(shí)現(xiàn)dna探針(fdna)所標(biāo)記熒光基團(tuán)在go表面的熒光猝滅與恢復(fù),通過熒光信號的變化直觀地分析recqe對雜交反應(yīng)的分子作用機(jī)制。recqe參與的檢測系統(tǒng)熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)高達(dá)22.56%,這表明recqe對go表面的雜交反應(yīng)具有明顯的促進(jìn)作用。recqe酶輔go傳感平臺檢測let-7a的靈敏度實(shí)驗(yàn)與特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,此傳感平臺能夠高特異性的區(qū)分各種堿基錯配的mirs并能準(zhǔn)確檢測系統(tǒng)相對應(yīng)的靶目標(biāo),能夠靈敏的定量檢測mir至0.18nm。這說明,此go傳感平臺并沒有因recqe的引入而影響其檢測靈敏度以及特異性,驗(yàn)證了recqe對此go傳感平臺的優(yōu)良兼容性。此外,fdna與阻斷dna(BDNA)組成的FDNA-BDNA復(fù)合探針可以有效阻止RecQE以及其他小分子蛋白與FDNA的非特異性結(jié)合,降低外界干擾所引起的系統(tǒng)背景熒光強(qiáng)度變化。(2)利用RecQE在FDNA-BDNA-GO傳感平臺當(dāng)中的作用機(jī)理,我們進(jìn)一步開發(fā)了一種基于RecQE酶促雜交鏈反應(yīng)(HCR)信號擴(kuò)增的靈敏檢測miR的GO傳感平臺。相比于無酶HCR/GO傳感平臺,RecQE酶促HCR/GO傳感平臺熒光信號強(qiáng)度表現(xiàn)出高達(dá)244.3%信號增強(qiáng),并將檢測時間從4 h縮短至50 min。條件優(yōu)化后的RecQE酶促HCR/GO傳感平臺應(yīng)用于檢測靶目標(biāo)let-7a的靈敏度實(shí)驗(yàn)與特異性實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,結(jié)果表明此傳感平臺對10 fM到2000 fM之間的目標(biāo)let-7a具有良好的檢測線性關(guān)系,能夠靈敏的檢測低至4.2 fM靶目標(biāo)的熒光信號,比無酶HCR/GO傳感平臺的檢測靈敏度高出兩個數(shù)量級。同時,此傳感平臺能夠高特異性的區(qū)分各種堿基錯配的miRs并能準(zhǔn)確檢測系統(tǒng)相對應(yīng)的靶目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)首次成功的將解旋酶應(yīng)用于高靈敏度檢測mi R的GO傳感平臺當(dāng)中,改善了無酶HCR/GO傳感平臺靈敏度低和效率低等不足,為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床早期診斷提供了又一可靠的、靈敏的miR定量方法。
[Abstract]:At present, molecular diagnostic biology is constantly changing the diagnosis of human disease. It can help doctors better understand the clinical status of each patient, such as the status of the current disease, the state of the disease, the drug reaction and the prognosis. The molecular diagnosis of molecular diagnosis is the sensitive detection of biomarkers, such as protein, Carbohydrates or nucleic acid.MicroRNAs (miRs), as a group of endogenous non coded RNA (18-25 nucleotides), plays an important role in a variety of disease cell processes. It is noteworthy that the frequent abnormal expression of miRs adds these small cell components to the potential biomarkers of cancer. Therefore, sensitive and effective detection parties The method is of great significance to better understand these relatively small nucleic acids and to further verify their function in the diagnosis of clinical molecules. However, because of their small size and high homology, the sensitive and economical miRs detection methods are still very challenging. In recent years, various sensitivity and specificity have been detected. The new methods for the study of heterosexual focus are in continuous development, such as nano particle composite probes, isothermal amplification methods and electrochemical methods. Among them, the principle of chain replacement, chain hybridization and chain extension, which most of the isothermal amplification methods rely on, is closely related to the nuclease, such as polymerase, endonuclease or incisiase, double stranded. Heteronuclease, a kind of important nuclease, is an important class of nuclease, which can use the energy of ATP hydrolysis to move along the nucleic acid skeleton of nucleic acid to separate two annealed nucleic acid chains (DNA chain, RNA chain or RNA-DNA hybrid chain). The hydrolytic activity of the hydrolytic enzyme to the hydrogen bond in the nucleic acid probe makes it have a huge amount in the corresponding molecular diagnostic system. Large potential application, especially the sensing system of hybridization reaction as detection principle. In this paper, Escherichia coli RecQ helicase (recqe) was induced by pet24a-recqe recombinant plasmid, and the mechanism of action and enzyme activity of recqe in different Mir oxidation Shi Moxi (go) sensing platform were systematically studied. The reaction of recqe in 1:1 hybridization reaction was analyzed. And the molecular mechanism of the hybridization chain reaction (HCR) as the sensing platform, a recqe assisted go sensing platform and a highly sensitive recqe hcr/go sensing platform were constructed, and the two sensing platforms were further studied. The main contents were as follows: (1) a recqe enzyme assisted go with the detection principle of 1:1 hybridization reaction was developed. The sensing platform is used to systematically study the molecular mechanism of the interaction between the helicase on the sensing platform. The sensing platform realizes the fluorescence quenching and recovery of the fluorescent groups marked by the DNA probe (FDNA) on the surface of the go through a simple dna/rna hybridization reaction. By the changes of the fluorescence signal, the molecular composition of the hybridization reaction is intuitively analyzed by the changes of the fluorescence signal. The intensity enhancement of the fluorescence signal of the detection system with the mechanism.Recqe is up to 22.56%, which indicates that recqe has an obvious promoting effect on the hybridization reaction on the go surface. The results of sensitivity and specificity of the.Recqe enzyme assisted go sensing platform to detect let-7a show that the sensing platform can distinguish a variety of base mismatched Mirs with high specificity. It can accurately detect the target target of the system, and can detect Mir to 0.18nm. sensitively. The go sensor platform does not affect its detection sensitivity and specificity because of the introduction of recqe, and validates the good compatibility of recqe go sensing platform. In addition, FDNA and FDNA-BDNA compound probe composed of blocking DNA (BDNA) can be used. In order to effectively prevent the non specific binding of RecQE and other small molecular proteins with FDNA, the changes of system background fluorescence intensity caused by external interference are reduced. (2) we have further developed a sensitive detection miR based on the amplification of RecQE enzyme catalyzed hybridization chain reaction (HCR) using the mechanism of RecQE in the FDNA-BDNA-GO sensing platform. GO sensing platform. Compared with the non enzyme HCR/GO sensing platform, the fluorescence signal intensity of the RecQE HCR/GO sensing platform is up to 244.3% signal intensities, and the RecQE enzyme promoting HCR/GO sensing platform after the optimization of the detection time from 4 h to 50 min. is applied to the sensitivity test and specific experiment of detecting target target let-7a. It shows that the sensing platform has a good linear relationship with the target let-7a between 10 fM and 2000 fM, and can detect the fluorescence signal of the target with a low to 4.2 fM target sensitively. It is two orders of magnitude higher than the detection sensitivity of the non enzyme HCR/GO sensing platform. At the same time, the sensing platform can distinguish a variety of base mismatched miRs with high specificity and can be highly specific. The target target of the system is detected accurately. In this experiment, the first successful application of the helicase to the GO sensing platform of high sensitivity detection of MI R has improved the low sensitivity and low efficiency of the non enzyme HCR/GO sensing platform, which provides a reliable and sensitive miR quantitative method for biomedical research and early clinical diagnosis.

【學(xué)位授予單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3

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本文編號：1862510