本文選題：纖維素酶 + CBMs　； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：纖維素類生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化利用是解決資源錯(cuò)置、環(huán)境污染與能源缺乏的重大課題,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。大部分天然纖維素降解酶都具有催化模塊(CDs)、碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)。CBMs具有識別和結(jié)合底物的功能,輔助CDs對底物的催化水解。設(shè)計(jì)獲得高效纖維素降解酶有兩大策略,第一提高纖維素酶蛋白對纖維素類底物的結(jié)合力,可以通過增加CBMs模塊的數(shù)量和提高CBMs和CDs對底物的結(jié)合力來實(shí)現(xiàn);其次,設(shè)計(jì)提高酶蛋白整體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。生物煉制產(chǎn)業(yè)采用高溫生產(chǎn)環(huán)境,能夠加快反應(yīng)速度并減少雜菌污染,因此需要高熱穩(wěn)定性的酶蛋白提高降解效率并降低生產(chǎn)成本。GH12家族的TrCel12A是只有一個(gè)CD模塊的嗜中溫內(nèi)切纖維素酶,只有234個(gè)氨基酸,結(jié)構(gòu)簡單,具有很大的改造空間。鑒于定向篩選的不確定性以及長時(shí)耗,本文綜合生物信息學(xué)分析手段與分子動力學(xué)模擬研究策略,對不同結(jié)合模式的CBMs家族進(jìn)行了功能架構(gòu)分析,來篩選適合與TrCel12A重組的CBMs模塊;運(yùn)用分子動力學(xué)模擬探究該酶的熱穩(wěn)定性機(jī)制,定位潛在的突變靶點(diǎn),并設(shè)計(jì)了四個(gè)突變期望提高該糖苷水解酶的熱穩(wěn)定性。計(jì)算方法和實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)合大大減少了實(shí)驗(yàn)測定的工作量。本文主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:(1)CBMs能夠自主折疊并發(fā)揮功能,在CAZy數(shù)據(jù)庫中,序列相似度30%以上的CBMs被歸于同一 CBMs家族,具有相似的結(jié)構(gòu)特征。對三種不同結(jié)合模式的7個(gè)CBMs家族進(jìn)行功能架構(gòu)分析,對研究CBMs的功能混雜性和理性設(shè)計(jì)提高CBMs結(jié)合力都具有重要理論價(jià)值。本文研究發(fā)現(xiàn),CBMs功能架構(gòu)處偏好芳香族氨基酸(W、Y)和極性氨基酸(Q、R、N),結(jié)合模式不同的CBMs對酸堿氨基酸的偏好不同,這是CBMs識別底物的分子基礎(chǔ);不同家族在功能架構(gòu)處采用增加亞位點(diǎn)數(shù)量或增加亞位點(diǎn)上的氨基酸數(shù)量來保障對底物的結(jié)合能力;功能架構(gòu)序列譜表明不同CBMs家族具有不同數(shù)量的底物結(jié)合亞位點(diǎn),而且與CDs相比,保守氨基酸數(shù)量相對較少,通常為芳香族氨基酸(W、Y)和弱極性氨基酸(N、Q),大部分分布在A型CBMs中;不同CBMs家族功能架構(gòu)上的絕對保守氨基酸、相對保守氨基酸和可變氨基酸識別碳水化合物底物糖環(huán)上各羥基氧原子的模式各不相同,從而不同CBMs家族可對結(jié)構(gòu)相近的碳水化合物底物進(jìn)行部分識別,這可能是不同CBMs家族產(chǎn)生功能混雜性的分子基礎(chǔ)。(2)應(yīng)用分子動力學(xué)模擬分析TrCel1A的熱穩(wěn)定性的影響因素。本文使用Gromacs軟件模擬溶劑環(huán)境,并設(shè)置了四個(gè)溫度梯度(300K、350K、400K、500K)對TrCel1A進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。分析RMSF值發(fā)現(xiàn)蛋白的柔性分布是不均勻的,蛋白的N末端和活性中心是高柔性位點(diǎn);四個(gè)位于不同二級結(jié)構(gòu)上的N末端突變的分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,引入大的疏水基團(tuán)(G41F)以及引入帶電基團(tuán)(Q6K)等方式能夠增強(qiáng)N末端內(nèi)部的相互作用,從而提高酶蛋白整體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;S25P通過引入內(nèi)酰胺環(huán)的方式降低了 α-螺旋的柔性,但是降低單個(gè)二級結(jié)構(gòu)的柔性沒有提高整體蛋白的熱穩(wěn)定性。(3)N末端突變對TrTe11A熱穩(wěn)定性的影響的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。使用大腸桿菌表達(dá)體系表達(dá)出四個(gè)突變體蛋白,在50℃、55℃、60℃進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢驗(yàn),G41F和Q6K在55℃和60℃下的酶活性高于野生型。DSC測定出的Q6K和G41F的Tm值比野生型高,證明G41F和Q6K提高了蛋白的熱穩(wěn)定性。這說明穩(wěn)定N末端結(jié)構(gòu)是提高纖維素酶熱穩(wěn)定性的有效方式以及分子動力學(xué)模擬方法的高效與可靠。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q55;O636.11

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