本文選題：端粒酶活性檢測(cè)　切入點(diǎn)：DNA機(jī)器　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物,其可在染色體末端添加端粒重復(fù)序列以維持端粒DNA長(zhǎng)度。端粒酶活性的增強(qiáng)可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)分裂乃至永生化,與癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān);端粒酶被認(rèn)為是一種重要的癌癥生物標(biāo)志物,其活性的靈敏檢測(cè)對(duì)于癌癥的早期診斷具有重要意義。DNA機(jī)器是指能夠在燃料物質(zhì)的引發(fā)下行使分子動(dòng)態(tài)機(jī)械功能的DNA裝備,其由于動(dòng)力學(xué)可控以及在分子相互作用研究上的優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。以DNA機(jī)器在納米水平的可控運(yùn)動(dòng)為基礎(chǔ),其應(yīng)用派生出多個(gè)方向,如信號(hào)放大型DNA機(jī)器、分子開(kāi)關(guān)DNA機(jī)器,其在構(gòu)建靈敏、特異的生物傳感平臺(tái)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。鑒于以上分析,本文利用兩種DNA機(jī)器構(gòu)建了熒光傳感平臺(tái)用于端粒酶活性的靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)。本文共分為三章:第一章為緒論,概述了端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)和功能、端粒酶活性與細(xì)胞衰老和腫瘤發(fā)生的關(guān)系、目前端粒酶活性的主要檢測(cè)方法及存在的不足。此外還介紹了 DNA機(jī)器的作用原理及其應(yīng)用進(jìn)展。第二章構(gòu)建了基于免標(biāo)記分子信標(biāo)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)增DNA機(jī)器用于端粒酶活性的靈敏檢測(cè)。該策略經(jīng)過(guò)級(jí)聯(lián)擴(kuò)增產(chǎn)生多個(gè)G-四倍體結(jié)構(gòu),端粒酶延伸產(chǎn)物廢物利用,與擴(kuò)增產(chǎn)生的G-四倍體共同用于信號(hào)輸出,提高了端粒酶活性檢測(cè)靈敏度。該方法在50 HeLa cells/mL到2000 HeLa cells/mL的范圍內(nèi)線性良好,能夠檢測(cè)到最低濃度為50 HeLa cells/mL中的端粒酶活性,優(yōu)于或媲美于現(xiàn)存的端粒酶活性檢測(cè)方法。此外,該方法被成功用于端粒酶活性抑制劑的抑制效應(yīng)分析,在其抑制劑篩選方面具有應(yīng)用潛能。第三章構(gòu)建了 一種基于DNA納米鑷子分子開(kāi)關(guān)的熒光策略用于端粒酶活性的比率型檢測(cè)。DNA-NT初始為打開(kāi)狀態(tài),熒光供體和受體遠(yuǎn)離,熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)效率低。端粒酶延伸產(chǎn)物能夠?qū)㈣囎娱]合,使熒光供體和受體靠近,FRET效率增強(qiáng)。通過(guò)DNA鑷子閉合前后的FRET響應(yīng)變化,將其用于端粒酶活性的比率型檢測(cè)。并通過(guò)置換鏈對(duì)鑷子的重新打開(kāi)以實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶持續(xù)合成能力的研究。本章利用凝膠電泳和熒光法驗(yàn)證了該方法的可行性,并在最優(yōu)條件下研究了其對(duì)端粒酶活性的檢測(cè)性能。
[Abstract]:Telomerase is a ribonucleoprotein complex that adds telomere repeats at the end of chromosomes to maintain telomere DNA length.The enhancement of telomerase activity leads to cell division and even immortality, which is closely related to the occurrence of diseases such as cancer. Telomerase is considered to be an important biomarker of cancer.The sensitive detection of its activity is of great significance for the early diagnosis of cancer. DNA machines are DNA equipment capable of performing molecular dynamic mechanical functions under the initiation of fuel substances.It has attracted much attention because of its controllable kinetics and its advantages in molecular interaction.Based on the controllable motion of the DNA machine at the nanometer level, its applications derive from many directions, such as signal playing large DNA machine and molecular switch DNA machine. It has a broad application prospect in the construction of sensitive and specific biosensor platform.In view of the above analysis, a fluorescence sensing platform was constructed by using two kinds of DNA machines for the sensitive and accurate detection of telomerase activity.This paper is divided into three chapters: the first chapter is the introduction, which summarizes the structure and function of telomere and telomerase, the relationship between telomerase activity and cell senescence and tumorigenesis.In addition, the principle of DNA machine and its application progress are also introduced.In chapter 2, a cascaded amplified DNA machine based on marker free molecular beacons was constructed for the sensitive detection of telomerase activity.The strategy can produce a number of G- tetraploid structures by cascade amplification and waste utilization of telomerase extension products, which can be used in signal output together with the expanded G- tetraploid, which improves the sensitivity of telomerase activity detection.The method has a good linearity in the range of 50 HeLa cells/mL to 2000 HeLa cells/mL, and can detect telomerase activity in 50 HeLa cells/mL at the lowest concentration, which is superior to or comparable to that of the existing methods.In addition, the method has been successfully used to analyze the inhibitory effect of telomerase activity inhibitors, and has potential application in screening of telomerase activity inhibitors.In chapter 3, we construct a fluorescence strategy based on DNA nano-tweezers molecular switch to detect telomerase activity. DNA-NT is initially open, fluorescence donor and receptor are far away, fluorescence resonance energy transfer resonance energy transfer fret is low.Telomerase extension products can close tweezers and increase the efficiency of fluorescent donors and receptors near fret.The changes of FRET response before and after closure of DNA tweezers were used to detect telomerase activity.The ability of telomerase sustained synthesis was studied by reopening tweezers by replacement chain.In this chapter, the feasibility of this method was verified by gel electrophoresis and fluorescence method, and the detection performance of telomerase activity was studied under the optimal conditions.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：O657.3

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本文編號(hào)：1694281