本文關(guān)鍵詞：立體選擇性氧化還原酶催化性能分析及其耦聯(lián)催化去消旋手性醇的研究　出處：《江南大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 立體選擇性氧化還原酶 催化性能 去消旋 輔酶循環(huán) (S)-N N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺

【摘要】：生物法制備手性醇,具有效率高、特異性和立體選擇性好以及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點。本研究從多種不同微生物來源的酶出發(fā),優(yōu)化誘導(dǎo)條件,得到活性表達(dá)的重組酶,構(gòu)建構(gòu)建立體選擇性氧化還原酶工具箱。并以多種潛手性芳基酮、脂肪酮和酮酯類化合物作為底物,研究其催化性能和規(guī)律。以(R,S)-苯基乙二醇(PED)為模式底物,構(gòu)建雙酶耦聯(lián)催化的去消旋體系,研究去消旋過程中輔酶自循環(huán)途徑的構(gòu)建方法,優(yōu)化反應(yīng)系統(tǒng)條件,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行(R,S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)去消旋獲得(S)-DHTP的體系構(gòu)建,具體內(nèi)容包括:(1)本研究收集了來源于8種微生物的20種立體選擇性氧化還原酶,通過對重組蛋白表達(dá)條件的研究,優(yōu)化重組酶的蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),除SCR、CPAR1最佳誘導(dǎo)溫度為30℃外,其他重組酶的最佳溫度為17℃。CPAR5、CPAR8在2%乳糖的誘導(dǎo)下表達(dá)量最高,CR4、KRD、SCR在0.5 mmol×L~(-1) IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)量最高,其他重組酶的最佳誘導(dǎo)劑為1 mmol×L~(-1) IPTG。對活性表達(dá)的重組菌進(jìn)行破碎收集上清液,通過Ni離子親和層析法分離純化得到各電泳純的重組氧化還原酶。(2)以純化好的重組酶作為催化劑,進(jìn)行不對稱催化性能考察,用14種潛手性芳基酮、脂肪酮和酮酯類化合物為底物,進(jìn)行底物特異性、動力學(xué)參數(shù)、立體選擇性研究。研究發(fā)現(xiàn)每種立體選擇性氧化還原酶都對多種潛手性底物具有活性,從底物角度來看,對于選定的底物,20種立體選擇性氧化還原酶表現(xiàn)出較大的差異性,其中對底物2-羥基苯乙酮、2’-氯苯基乙酮、3’-氯苯基乙酮、4-溴苯乙酮、2-辛酮、乙酰乙酸甲酯的催化活力高于其它,而對于底物鄰羥基苯乙酮、2-庚酮的催化活力相對較弱。本研究所構(gòu)建的立體選擇性氧化還原酶工具箱具有較寬的底物譜、較優(yōu)的催化效率和突出的立體選擇性,可以比較理想的催化不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。(3)以(R,S)-PED為模式底物構(gòu)建的雙酶耦聯(lián)催化去消旋體系生成(R)-PED。此體系通過耦聯(lián)兩種立體選擇性氧化還原酶來構(gòu)建,這兩種酶分別是stereospecific carbonyl reductase 1(SCR1)和ketoreductase(KRD)。為平衡多酶體系中不同酶的活性和催化功能,優(yōu)化SCR1催化的氧化反應(yīng)和KRD催化的還原反應(yīng)的條件。據(jù)此,構(gòu)建出來擁有輔酶自循環(huán)體系生產(chǎn)(R)-PED的去消旋體系,在最優(yōu)反應(yīng)條件SCR1/KRD活力比為1:4、NADP+/NADPH比例為3:1、30℃、pH 7.0時,有95.50%e.e.光學(xué)純度和91.62%的產(chǎn)率。這一去消旋體系構(gòu)建方法可以用來構(gòu)建基于酶學(xué)性質(zhì)系統(tǒng)評價的多酶去消旋體系。(4)根據(jù)上文中構(gòu)建去消旋體系的方法,在(R,S)-DHTP去消旋獲得(S)-DHTP的體系構(gòu)建中,首先篩選獲得分別催化氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)的重組酶stereospecific carbonyl reductase 3(SCR3)和carbonyl reductase 2(CR2),并在對酶催化條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,選擇去消旋體系的反應(yīng)條件為三乙醇胺緩沖液(pH 8.0)、30℃、1 mmol×L~(-1) ZnSO4。據(jù)此,構(gòu)建出擁有輔酶自循環(huán)體系的去消旋體系,在最優(yōu)反應(yīng)條件SCR3/CR2活力比為1:2、輔酶添加比NADP+/NADPH為3:1時,可從反應(yīng)體系中獲得的(S)-DHTP,產(chǎn)率和光學(xué)純度分別高達(dá)89.45%和91.71%e.e.。在底物濃度為4 g×L~(-1)時,產(chǎn)物(S)-DHTP的產(chǎn)率和光學(xué)純度分別為78.29%和86.79%e.e.。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
，

本文編號：1353316