本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)微量樣本的制備與質(zhì)譜分析技術(shù)

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【摘要】：本論文針對基礎(chǔ)與臨床蛋白質(zhì)組研究中,微量蛋白質(zhì)組樣本的制備與質(zhì)譜分析的需求,開展了兩個(gè)方面的研究工作：(1)石蠟包埋組織的蛋白質(zhì)提取與規(guī)模化鑒定方法學(xué)研究；(2)小鼠肝臟細(xì)胞類型的分離純化。通過福爾馬林固定和石蠟包埋,臨床病理組織能夠獲得很好的保存。這些樣本具備完善的病理信息及臨床跟蹤信息,是極好的疾病蛋白質(zhì)組研究與疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究對象。為了深入挖掘這些樣本所蘊(yùn)含的生物學(xué)與臨床價(jià)值,一種有效的策略,是針對石蠟包埋組織開展規(guī)�；牡鞍踪|(zhì)組分析,利用定量研究策略,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)及候選分子標(biāo)志物。在第一部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中,我們建立了包埋組織蛋白質(zhì)的提取方法。同時(shí),針對回收的微量蛋白質(zhì),比較了采用普通膠內(nèi)酶切和原位凝膠膠內(nèi)酶切兩種方法,開展蛋白質(zhì)的規(guī)�；b定。結(jié)果顯示,福爾馬林固定石蠟包埋的鼠肝組織樣本經(jīng)回收后,可以獲得與新鮮鼠肝樣本表達(dá)譜相近的鑒定效果,說明固定和包埋過程對于組織樣本的表達(dá)譜鑒定沒有影響,常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程,可以兼容石蠟包埋的鼠肝組織。微量蛋白質(zhì)組樣本處理過程中,需要考慮在去除溶液中的污染小分子的同時(shí)、盡量避免樣本損失,聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)提供了一個(gè)很好的介質(zhì)。本研究比較了將微量樣本,先進(jìn)行短區(qū)間SDS-PAGE分離,以及直接將蛋白質(zhì)固化到PAGE凝膠兩種方法。利用短區(qū)間的SDS-PAGE,在一個(gè)90 min的質(zhì)譜梯度中,我們實(shí)現(xiàn)了從10μg的Hela全細(xì)胞裂解液中鑒定到2931個(gè)蛋白。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,我們從10μg新鮮凍存鼠肝樣本和等量的石蠟包埋鼠肝組織樣本中分別鑒定到2301和2264個(gè)蛋白,上述結(jié)果一方面說明,石蠟包埋組織內(nèi)的蛋白質(zhì)可以有效提取,同時(shí),SDS-PAGE膠內(nèi)酶切技術(shù)可以穩(wěn)定地應(yīng)用于微量樣本蛋白質(zhì)組分析中。我們比較了用原位凝膠(in-situ PAGE)膠內(nèi)酶切的方法,來處理上述樣本。該方法的特點(diǎn)是,蛋白質(zhì)混合物在PAGE膠凝固的同時(shí),固化到膠中,后續(xù)的小分子污染物清洗和蛋白質(zhì)酶解,完全等同于SDS-PAGE分離后的樣本。因此,in-situ方法,較普通的膠內(nèi)酶切要簡單。基于該方法,分別從10μg的人Hela細(xì)胞裂解液、新鮮凍存鼠肝樣本、石蠟包埋鼠肝樣本最高鑒定到2327、2164和2077個(gè)蛋白,略低于用膠內(nèi)酶切達(dá)到的鑒定量。但是,in-situ PAGE方法處理后,蛋白質(zhì)的鑒定量十分穩(wěn)定,說明in-situ PAGE方法可能更適用于非標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組分析應(yīng)用。針對石蠟包埋組織的分析發(fā)現(xiàn),福爾馬林固定并沒有對酶切產(chǎn)生不良影響。同時(shí),從總離子流色譜圖的肽段洗脫順序中,我們發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定及石蠟包埋的特殊處理過程,并不會(huì)影響肽段混合物的整體親疏水性分布。這些結(jié)果說明石蠟包埋組織塊,完整地儲(chǔ)存了臨床樣本中的蛋白質(zhì)組信息,具備開展規(guī)模化分析及候選生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的潛力。在第二部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中,我們意圖將小鼠肝臟實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分類,獲得微量的肝臟細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),也為后期的分泌蛋白質(zhì)組及肝臟細(xì)胞類型蛋白質(zhì)組研究奠定基礎(chǔ)。我們改進(jìn)Seglen的膠原法,獲得肝臟原位循環(huán)灌流的方法,對小鼠肝臟進(jìn)行灌流和消化,再經(jīng)過細(xì)胞篩過濾,獲得了細(xì)胞混合懸浮液。進(jìn)一步用差速離心的方法對細(xì)胞混合懸浮液進(jìn)行分離,我們獲得了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)觀察和免疫印跡驗(yàn)證證實(shí)我們獲得了較純的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞；
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q51;O657.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃凰;楊燕;劉嘉;張振華;田擁軍;王寶菊;郝友華;楊東亮;;中國旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識(shí)別域的原核表達(dá)及復(fù)性[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2006年04期

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本文編號：1190708