發(fā)布時間：2017-11-14 04:00

  本文關(guān)鍵詞：菌株P(guān)seudomonas koreensis UVCN18的聚-β-羥基丁酸酯聚合酶基因的克隆與表達(dá)

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【摘要】：PHA(聚羥基脂肪酸酯)是微生物在碳氮比失衡的條件下,在胞內(nèi)合成的一種聚酯,這種聚酯可以作為碳源和能源在胞內(nèi)積累。PHB是至今為止PHA家族中研究最多、最徹底的典型成員,具有良好的生物降解性、生物相容性和熱加工特性,其分解產(chǎn)物可全部被微生物所利用,對環(huán)境不會造成任何污染,在環(huán)保、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和食品等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。但由于生產(chǎn)PHB菌種產(chǎn)率低、底物轉(zhuǎn)化率低、工藝復(fù)雜、成本高以及產(chǎn)品后續(xù)應(yīng)用型產(chǎn)品開發(fā)少等,嚴(yán)重制約了PHB的廣泛應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。為了降低生產(chǎn)成本,PHB的生產(chǎn)方法成為研究熱點,其中利用微生物基因工程法是目前研究的主要方向,利用大腸桿菌作為表達(dá)菌株,構(gòu)建工程菌,不僅利用大腸桿菌具有生長迅速,培養(yǎng)基原料來源廣等優(yōu)點,而且基因工程菌株生產(chǎn)PHB大大提高了產(chǎn)率,顯示出巨大的開發(fā)潛力。本研究以菌株P(guān)seudomonas koreensis UVCN18基因組DNA為模板,成功克隆了菌株P(guān)seudomonas koreensis UVCN18中的PHB聚合酶基因。構(gòu)建出克隆載體pMD18-T-phbC和表達(dá)載體pET-28a(+)-phbC,并構(gòu)建工程菌通過IPTG誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting鑒定,菌株P(guān)seudomonas koreensis UVCN18的PHB聚合酶基因phbC實現(xiàn)了異源蛋白表達(dá)。本研究的具體內(nèi)容如下:(1)根據(jù)NCBI上已公布的假單胞菌屬的phbC基因設(shè)計引物。以菌株P(guān)seudomonas koreensis UVCN18基因組DNA為模板,成功克隆了菌株P(guān)seudomonas koreensis UVCN18中的PHB聚合酶基因。通過生物信息學(xué)分析表明,該基因全長為1704bp,通過BlastP序列對比發(fā)現(xiàn),該基因所表達(dá)的氨基酸屬于PHA聚合酶家族,與菌種Pseudomonas putida(AHG99486)同源性達(dá)96%。將獲得的基因序列提交到NCBI,得到登錄號為KT716020。(2)克隆載體的構(gòu)建:將所PCR擴增后獲得的PHB聚合酶基因目的基因,與pMD18-T載體連接,獲得重組質(zhì)粒pMD18T-phbC,并成功將質(zhì)粒pMD18T-phbC轉(zhuǎn)入到大腸桿菌JM109中,獲得克隆菌株。(3)表達(dá)載體的構(gòu)建:將克隆載體上的PHB聚合酶基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a(+)上,構(gòu)建原核基因重組質(zhì)粒pET-28a(+)-phbC,轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株中,通過含有卡那霉素的培養(yǎng)基篩選,獲得重組菌株E.coliBL21-pET-28a(+)-phbC。(4)鑒定表達(dá):重組表達(dá)菌株E.coliBL21-pET-28a(+)-phbC經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)后,提取粗酶液,通過SDS-PAGE電泳及Western blotting鑒定,結(jié)果與PHB聚合酶分子量63KDa理論相符合,證明實現(xiàn)了異源蛋白表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;O633.14

【共引文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 胡忠輝;船舶航向運動非線性自適應(yīng)及優(yōu)化控制方法研究[D];哈爾濱工程大學(xué);2013年

2 宋楊;船舶減搖無模型自適應(yīng)控制技術(shù)研究[D];大連理工大學(xué);2013年

3 王淑平;對稱系統(tǒng)的耗散性分析與控制[D];天津大學(xué);2011年

4 朱松;隨機回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的動力學(xué)行為研究[D];華中科技大學(xué);2010年

5 張保勇;時滯系統(tǒng)穩(wěn)定與控制：進(jìn)一步的分析與研究[D];南京理工大學(xué);2011年

6 朱進(jìn);遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性和無源性分析[D];東北大學(xué);2010年

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本文編號：1183726