本文關(guān)鍵詞：基于DNA雜交鏈反應(yīng)放大策略的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性及羥甲基化程度電化學(xué)分析

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【摘要】：DNA甲基化是目前研究最多的DNA表觀遺傳修飾之一。DNA甲基化由DNA甲基轉(zhuǎn)化移酶催化完成的。由于DNA甲基化狀態(tài)是可被逆轉(zhuǎn)的,也就是存在DNA去甲基化過程,但相對(duì)于甲基化過程,去甲基化過程更加復(fù)雜。DNA的甲基化與去甲基化這兩個(gè)過程相互平衡,維持了DNA甲基化模式的穩(wěn)定。大量研究表明,許多重要的過程如胚胎發(fā)育和細(xì)胞周期調(diào)控都與甲基化息息相關(guān),而多個(gè)癌癥也表現(xiàn)出異常的甲基化模式。因此,發(fā)展簡(jiǎn)易、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的用于定位、定量分析DNA甲基化的方法是至關(guān)重要的。相對(duì)于其他方法,電化學(xué)擁有如檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、易于小型化等諸多優(yōu)勢(shì),是一種具有良好發(fā)展前景的分析測(cè)試方法。本論文旨在建立某些疾病DNA的電化學(xué)、去甲基化程度的電化學(xué)檢測(cè)方法,為某些疾病的臨床診斷和治療觀察提供準(zhǔn)確、快速和靈敏的方法。本論文的主要工作是通過DNA雜交鏈反應(yīng),實(shí)現(xiàn)DNA甲基化、去甲基化狀態(tài)及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的電化學(xué)信號(hào)放大檢測(cè)。1.DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(MTase)活性與腫瘤發(fā)生,發(fā)展密切相關(guān)。本文建立了免標(biāo)記超結(jié)構(gòu)電化學(xué)方法用于信號(hào)放大檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性(例如使用M.SssI甲基化轉(zhuǎn)移酶)�？刂乒潭ㄔ诮痣姌O上低密度的DNA有利于形成DNA超結(jié)構(gòu),從而有效地實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。以RuHex作為電化學(xué)信號(hào)分子,可以靜電吸附到雙鏈DNA上,實(shí)現(xiàn)了免標(biāo)記的電化學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明,使用差分脈沖伏安法(DPV)能夠有效的檢測(cè)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性,線性范圍為0.5-120U/mL,信噪比為3時(shí),檢出限為0.025 U/mL。此外,在細(xì)胞裂解液內(nèi)依然可以檢測(cè)甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性。同時(shí),本文也證實(shí)了該方法應(yīng)用于快速估測(cè)和篩選甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑,它可以有助于探索與甲基化相關(guān)的抗癌藥物。2.DNA去甲基化過程是DNA甲基化的可逆過程,研究發(fā)現(xiàn),5-甲基胞嘧啶(5mC)在TET酶的催化氧化作用下生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC的發(fā)現(xiàn)為DNA去甲基化研究提供了新的思路。且5hmC在體細(xì)胞重編程,胚胎發(fā)育和啟動(dòng)哺乳動(dòng)物DNA去甲基化中有重要作用。因此檢測(cè)DNA樣品中5hmC的含量是十分必要的。在本文中,我們建立了基于DNA雜交鏈反應(yīng)(HCR)信號(hào)擴(kuò)增電化學(xué)方法用來有效的量化DNA羥甲基化程度。當(dāng)DNA序列中羥基化的胞嘧啶在UDP-glucose存在下被T4-βGT作用形成5ghmC,并阻礙MspJI識(shí)別剪切,經(jīng)輔助DNA (FcA-S3S4)雜交作用后,與吸附到DNA鏈上的RuHex形成電子轉(zhuǎn)移通道,使信號(hào)放大。(I2-I0/I1-I0)代表雙鏈DNA羥基化比例,實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)羥甲基化DNA的比例在1%到90%范圍內(nèi),(I2-I0/I1-I0)呈線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)是0.9967,信噪比為3時(shí),估算最低檢測(cè)限是0.05%。該方法因其靈敏度高和響應(yīng)速度快。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q523;O657.1

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本文編號(hào)：1180051