本文關鍵詞：“蓋子”區(qū)域帶電氨基酸及C-端肽鏈對脂肪酶HL1232催化活性及選擇性的調(diào)控研究

  更多相關文章： 脂肪酶 定點突變 蓋子結構 C-端肽鏈 酶學性質(zhì) 生物信息學

【摘要】：HL1232脂肪酶(又稱PLA1),是由Thermomyces lanuginosus lipase基因和Fusarium oxysporum phospholipase基因融合并重組表達獲得的。該酶不僅表現(xiàn)出脂肪酶活性,同時還具有磷脂酶活性。HL1232脂肪酶空間結構中的“蓋子”使其表現(xiàn)出界面激活效應�！吧w子”結構的不同狀態(tài),決定了該脂肪酶是否具有催化底物水解活性。本文以HL1232脂肪酶為研究對象,在本實驗室之前的工作基礎上,通過對其“蓋子”區(qū)域的三個帶電荷氨基酸位點進行進一步定點突變研究,對這三個關鍵氨基酸在HL1232脂肪酶性質(zhì)與功能中的作用進行了更為深入的研究。另外,磷脂酶活力是HL1232脂肪酶的一個重要性質(zhì),該脂肪酶能催化磷脂底物水解的特性使其被廣泛用于油脂脫膠工業(yè)中。通過對HL1232脂肪酶氨基酸序列進行分析及比對,我們對C-端肽鏈在HL1232脂肪酶磷脂酶活力表現(xiàn)中的作用進行了研究。論文的具體內(nèi)容及結果如下:1,“蓋子”區(qū)域帶電荷氨基酸在酶催化活性中的影響研究。在本實驗室之前的工作基礎上,補加了對R81,R84及E87位點的單點突變,根據(jù)氨基酸性質(zhì),將該三位點氨基酸殘基分別突變成帶相反電荷氨基酸,即設計突變體R81E,R84E及E87R;并在單點突變體的研究基礎上,設計了多點突變體R81AR84M,R81AE87Q,R84ME87Q及R81AR84ME87Q,以全面研究該三位點不同氨基酸特性對HL1232脂肪酶酶學性質(zhì)的影響;利用定點突變技術,以實驗室構建的野生型表達載體pGAPZaA-HL1232出發(fā),構建各突變體表達載體,并成功在畢赤酵母X-33中重組表達。發(fā)酵上清液經(jīng)Q陰離子交換柱分離純化,獲得純化野生型及突變體重組蛋白。以純化的HL1232脂肪酶野生型及其突變體為研究對象,分別測定各突變體水解橄欖油底物與大豆卵磷脂底物的酶學性質(zhì)。結果顯示,R84E突變體水解兩種底物的酶活力較野生型都有所上升;R81E突變體酶活力則與野生型相差不大,且其水解兩種底物的最適反應條件相同,均為pH6.0,45℃;而E87R突變體的比酶活有所下降,且其反應的最適溫度發(fā)生了巨大變化,其水解橄欖油底物及卵磷脂底物的最適反應溫度由野生型的45℃、55℃分別下降至30℃、45℃。分析各多點突變體,雖然其單點突變酶活力均有很大程度提升,但除R81AE87Q外,其他三個多點突變體的比酶活均比野生型低,多點突變的酶學性質(zhì)的改變不是單點突變的簡單累加結果。2,C-端肽鏈在酶底物選擇性中的作用研究。根據(jù)HL1232脂肪酶序列分析,設計了突變體D263-317,D270-317,S263-269及S263-269D270-317,對該段C-端肽鏈進行替換或缺失,以定向研究該段肽鏈在HL1232脂肪酶表現(xiàn)磷脂酶活力中的作用;并在此基礎上,以263-269氨基酸殘基片段中的唯一帶電荷氨基酸殘基D266為對象,設計了突變體D266A,D266E,D266E,以研究該位點在HL1232脂肪酶性質(zhì)與功能中的作用。構建各突變體表達載體,并使其在畢赤酵母中成功重組表達。目的蛋白突變體經(jīng)純化后,分別測定各突變體水解橄欖油底物與大豆卵磷脂底物的酶學性質(zhì)。結果顯示,HL1232脂肪酶的C-端肽鏈的缺失或替換,其酶學性質(zhì)發(fā)生了很大變化。D263-317和S263-269突變體水解大豆卵磷脂的最適pH均由野生型的酸性條件(pH 5.0)變成了中性條件(pH 7.0),且S263-269突變體水解橄欖油底物的最適pH由中性條件(pH 7.0)上升為pH 9.0,D263-317水解兩種底物的比酶活大大降低。263-269氨基酸胺基片段的替換會改變該脂肪酶對水解磷脂底物與三酯底物的偏好性。各C-端肽鏈突變體的PL/TG均發(fā)生巨大變化,由野生型的0.828分別下降為0.802(D263-317),0.601(D270-317),0.328(S263-269),0.115(S263-269D270-317)。3,通過生物信息學的進一步分析發(fā)現(xiàn),“蓋子”區(qū)域氨基酸殘基與周圍氨基酸殘基及外界環(huán)境間的相互作用(包括Cation-π,氫鍵,鹽橋,疏水相互作用等)對“蓋子”結構構象的轉(zhuǎn)變起著重要的作用,這些相互作用力影響“蓋子”結構的靈活性,并影響其閉合狀態(tài)或開放狀態(tài)的穩(wěn)定性,進而影響該酶的催化效率;HL1232脂肪酶C-端肽鏈為其催化中心營造的極性環(huán)境可能是其具有磷脂酶活力的原因之一。
【關鍵詞】：脂肪酶 定點突變 蓋子結構 C-端肽鏈 酶學性質(zhì) 生物信息學
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-23
• 1.1 脂肪酶簡介12-18
• 1.1.1 脂肪酶定義12
• 1.1.2 脂肪酶的結構基礎及催化機制12-17
• 1.1.3 脂肪酶的磷脂酶活性17
• 1.1.4 脂肪酶的分子改造17-18
• 1.2 HL1232脂肪酶簡介18-20
• 1.2.1 HL1232脂肪酶的蛋白序列信息18-19
• 1.2.2 HL1232脂肪酶的結構基礎19
• 1.2.3 HL1232脂肪酶的應用19-20
• 1.3 立題背景與意義20-21
• 1.4 研究內(nèi)容及研究路線21-23
• 1.4.1 研究內(nèi)容21
• 1.4.2 技術路線21-23
• 第二章“蓋子”區(qū)域帶電荷氨基酸對HL1232脂肪酶酶學性質(zhì)的影響研究23-48
• 2.1 引言23
• 2.2 實驗材料和儀器23-28
• 2.2.1 菌株與載體23
• 2.2.2 試劑23-24
• 2.2.3 常用實驗儀器24-25
• 2.2.4 培養(yǎng)基及溶液的配制25-28
• 2.3 實驗方法28-36
• 2.3.1 突變體設計28
• 2.3.2 突變體表達載體構建28-33
• 2.3.3 HL1232脂肪酶突變體的表達與純化33-34
• 2.3.4 HL1232脂肪酶突變體酶學性質(zhì)測定34-36
• 2.4 結果與討論36-47
• 2.4.1 引物設計36-37
• 2.4.2 HL1232脂肪酶突變體大腸桿菌DH5a菌株的篩選與鑒定37-38
• 2.4.3 HL1232脂肪酶突變體畢赤酵母X-33 表達菌株的篩選與鑒定38
• 2.4.4 HL1232脂肪酶突變體的表達與純化38-39
• 2.4.5 脂肪酶HL1232突變體最適反應pH測定39-42
• 2.4.6 HL1232脂肪酶突變體最適反應溫度測定42-44
• 2.4.7 HL1232脂肪酶“蓋子”區(qū)域帶電荷氨基酸殘基酶學性質(zhì)匯總44-47
• 2.5 本章小結47-48
• 第三章 C-端肽鏈在HL1232脂肪酶底物選擇性中的作用研究48-61
• 3.1 引言48
• 3.2 實驗材料和儀器48
• 3.3 實驗方法48-50
• 3.3.1 突變體設計48-49
• 3.3.2 突變體表達載體構建、發(fā)酵表達及純化49-50
• 3.3.3 突變體酶學性質(zhì)測定50
• 3.4 結果與討論50-60
• 3.4.1 引物設計50
• 3.4.2 HL1232脂肪酶突變體大腸桿菌DH5a菌株的篩選與鑒定50-51
• 3.4.3 HL1232脂肪酶突變體畢赤酵母X-33 表達菌株的篩選與鑒定51-52
• 3.4.4 HL1232脂肪酶突變體的表達與純化52-53
• 3.4.5 脂肪酶HL1232突變體最適反應pH測定53-56
• 3.4.6 HL1232脂肪酶突變體最適反應溫度測定56-58
• 3.4.7 脂肪酶HL1232 C-端肽鏈定向改造突變體酶學性質(zhì)結果總結58-60
• 3.5 本章小節(jié)60-61
• 第四章 HL1232脂肪酶及其突變體生物信息學分析61-75
• 4.1 引言61
• 4.2 HL1232脂肪酶生物信息學分析及模型構建61-65
• 4.2.1 HL1232脂肪酶氨基酸序列分析61-63
• 4.2.2 HL1232脂肪酶模型構建63-64
• 4.2.3 HL1232脂肪酶模型評估64-65
• 4.3 HL1232脂肪酶“蓋子”區(qū)域與其酶活力關系65-71
• 4.3.1“蓋子”區(qū)域突變體與野生型酶活力對比65
• 4.3.2“蓋子”區(qū)域突變體結構分析65-71
• 4.4 C-端肽鏈與HL1232脂肪酶磷脂酶活力關系71-73
• 4.4.1 C-端肽鏈定向改造相關突變體與野生型酶學性質(zhì)對比71-72
• 4.4.2 C-端肽鏈在脂肪酶HL1232水解磷脂底物作用中的生物信息學分析72-73
• 4.5 本章小結73-75
• 結論與展望75-77
• 結論75
• 創(chuàng)新點75
• 展望75-77
• 參考文獻77-83
• 攻讀碩士學位期間取得的研究成果83-84
• 致謝84-85
• 附件85

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 付敏;趙謀明;劉寧;仇超穎;趙強忠;;固定化磷脂酶Lecitase~ Ultra催化合成果糖月桂酸單酯的研究[J];現(xiàn)代食品科技;2012年09期

2 趙夢夢;薛正蓮;黃祖耀;蘇燕南;馬琦亞;;三種磷脂酶A1活力測定方法的比較[J];食品與發(fā)酵科技;2012年03期

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本文編號：1025760