本文關(guān)鍵詞：堿處理超濾法提純透明質(zhì)酸鈉

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【摘要】：以透明質(zhì)酸鈉(SH)粗品為原料,采用Na OH溶液堿化處理后再經(jīng)過(guò)超濾得到醫(yī)用級(jí)SH純品。采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)法表征SH純品結(jié)構(gòu),稀溶液粘度法測(cè)定SH純品粘均分子量,熱重分析(TG)法測(cè)定SH純品熱穩(wěn)定性,紫外分光光度計(jì)測(cè)定SH純品葡萄糖醛酸含量,庫(kù)馬斯亮藍(lán)法測(cè)定SH純品蛋白質(zhì)含量,紫外分光光度計(jì)測(cè)定SH純品核酸含量,MTT細(xì)胞計(jì)數(shù)和顯微觀察法測(cè)試SH純品的體外HEK293細(xì)胞毒性。正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn),研究堿處理反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和Na OH溶液濃度對(duì)SH純品各項(xiàng)指標(biāo)(葡萄糖醛酸含量、蛋白質(zhì)含量、核酸含量、粘均分子量和產(chǎn)率)的影響程度和機(jī)理,篩選出符合醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)的SH純品。通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)去除菌體前后樣品計(jì)數(shù)研究堿處理超濾工藝去除SH粗品中添加的菌體情況,通過(guò)傳統(tǒng)半數(shù)組織細(xì)胞感染量TCID50法和熒光定量PCR(qPCR)方法分別研究堿處理超濾工藝去除SH粗品中添加的病原體情況。研究結(jié)果表明:堿處理反應(yīng)溫度是影響SH純品粘均分子量的關(guān)鍵因素,堿處理反應(yīng)溫度在60℃左右,可以得到高分子量的SH純品,繼續(xù)升高堿處理反應(yīng)溫度,SH純品粘均分子量和產(chǎn)率下降明顯。而堿處理反應(yīng)溫度對(duì)SH純品蛋白質(zhì)含量和核酸含量卻沒有太大的影響,表明在一定的堿處理反應(yīng)時(shí)間后,SH粗品中的雜蛋白及其核酸得到充分的降解。NaOH溶液濃度對(duì)SH純品的葡萄糖醛酸含量影響較大,當(dāng)Na OH溶液質(zhì)量百分比濃度為0.2%時(shí)(70℃,90 min),SH純品葡萄糖醛酸含量達(dá)到46.17%,而粘均分子量為1.49×106,蛋白質(zhì)含量為0.04%,核酸OD值為0.63,產(chǎn)率為40.75%,繼續(xù)增加Na OH溶液濃度,SH純品葡萄糖醛酸含量以及產(chǎn)率下降明顯,表明葡萄糖醛酸受到破壞。反應(yīng)時(shí)間對(duì)SH純品蛋白質(zhì)和核酸含量影響最明顯,隨反應(yīng)時(shí)間增加,SH粗品中更多的雜蛋白以及核酸分子降解成小分子并被超濾掉。因此,提純SH粗品的最佳堿處理反應(yīng)條件是:堿處理反應(yīng)溫度為60℃,反應(yīng)時(shí)間為60 min,Na OH溶液質(zhì)量百分比濃度為0.2%;所提純的SH純品葡萄糖醛酸含量為46.87%,而粘均分子量為1.60×106,蛋白質(zhì)含量為0.05%,核酸OD值為0.33,產(chǎn)率為65.35%,達(dá)到醫(yī)用SH純品標(biāo)準(zhǔn)。此最佳SH純品的FTIR譜圖與SH標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致,熱分解反應(yīng)溫度為210.5℃,體外對(duì)HEK293細(xì)胞無(wú)明顯毒性。堿處理超濾工藝通過(guò)堿處理殺滅并分解細(xì)菌成小分子物質(zhì),再經(jīng)過(guò)超濾除去,達(dá)到了有效滅菌的效果。傳統(tǒng)TCID50病毒過(guò)半數(shù)死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:堿處理超濾工藝通過(guò)堿處理滅活病原體后再經(jīng)超濾除去,SH純品中幾乎沒有病原體存在。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SH純品經(jīng)過(guò)qPCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增曲線是一條平直線,說(shuō)明沒有DNA擴(kuò)增,對(duì)照病毒梯度濃度的曲線可以看出沒有基因殘留,表明堿化超濾處理去除病毒的效果非常理想。以Na OH堿化水解處理SH粗品中雜蛋白、核酸、細(xì)菌和病毒成分,再通過(guò)超濾方法可以得到SH純品。與CTAB方法和氯苯酶解方法相比,該提純方法工藝操作流程簡(jiǎn)單,解決了目前SH提純工藝復(fù)雜的問題;此外,堿處理超濾法提純的SH產(chǎn)品純度高,粘均分子量高,殘余蛋白質(zhì)及核酸含量極低,無(wú)細(xì)菌和病毒,達(dá)到醫(yī)用SH純品標(biāo)準(zhǔn),具有醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：透明質(zhì)酸鈉 堿處理超濾法 粘均分子量 葡萄糖醛酸 蛋白質(zhì) 核酸
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O636
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 第一章 前言10-22
• 1.1 SH概述10-12
• 1.1.1 SH的結(jié)構(gòu)10-11
• 1.1.2 影響SH性能的因素11-12
• 1.1.3 SH的來(lái)源12
• 1.2 SH在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用12-16
• 1.2.1 醫(yī)學(xué)美容整形12-14
• 1.2.2 骨科14-15
• 1.2.3 腹盤腔外科15-16
• 1.3 SH的提純及檢驗(yàn)方法16-20
• 1.3.1 SH的提純方法16-17
• 1.3.1.1 堿處理超濾16
• 1.3.1.2 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）沉淀法16
• 1.3.1.3 氯苯酶解法16
• 1.3.1.4 其他方法16-17
• 1.3.2 SH的結(jié)構(gòu)與純度檢驗(yàn)方法17-18
• 1.3.2.1 粘度與分子量17-18
• 1.3.2.2 葡萄糖醛酸含量18
• 1.3.2.3 核酸OD值18
• 1.3.2.4 蛋白質(zhì)含量18
• 1.3.3 菌體與病原體檢驗(yàn)方法18-20
• 1.3.3.1 菌體檢驗(yàn)方法18-19
• 1.3.3.2 病原體檢驗(yàn)方法19-20
• 1.4 本課題研究的目的和意義20
• 1.5 本課題研究的內(nèi)容和方法20-21
• 1.5.1 研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.5.2 研究方法21
• 1.6 本課題創(chuàng)新點(diǎn)21-22
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方法22-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.3 CTAB法提純SH24
• 2.4 氯苯酶解法提純SH24
• 2.5 堿處理超濾法提純SH24-25
• 2.6 純品結(jié)構(gòu)與熱性能表征25-27
• 2.6.1 傅里葉變換紅外光譜25
• 2.6.2 葡萄糖醛酸含量25-26
• 2.6.3 粘度及分子量26-27
• 2.6.4 熱重分析27
• 2.7 純品純度指標(biāo)分析27-28
• 2.7.1 核酸OD值27
• 2.7.2 蛋白質(zhì)含量27-28
• 2.8 純品體外HEK293細(xì)胞毒性試驗(yàn)28-29
• 2.8.1 定性評(píng)價(jià)28
• 2.8.2 MTT法實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程28-29
• 2.9 平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)去除菌體前后樣品計(jì)數(shù)29-30
• 2.10 采用半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）對(duì)去除病原體前后樣品計(jì)數(shù)30-32
• 2.11 QPCR去除病原體前后樣品對(duì)照32-35
• 第三章 結(jié)果與討論35-75
• 3.1 堿處理超濾反應(yīng)條件對(duì)純品結(jié)構(gòu)及純度的影響35-51
• 3.1.1 正交實(shí)驗(yàn)影響因素分析35-39
• 3.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及純度的影響39-45
• 3.1.2.1 紅外光譜分析39-41
• 3.1.2.2 熱重分析41-42
• 3.1.2.3 粘度及分子量42
• 3.1.2.4 葡萄糖醛酸含量42-43
• 3.1.2.5 核酸OD值43-44
• 3.1.2.6 蛋白質(zhì)含量44
• 3.1.2.7 產(chǎn)率44-45
• 3.1.3 反應(yīng)堿溶液質(zhì)量百分比濃度對(duì)純品結(jié)構(gòu)及純度的影響45-48
• 3.1.3.1 粘度及分子量45
• 3.1.3.2 葡萄糖醛酸含量45-46
• 3.1.3.3 核酸OD值46-47
• 3.1.3.4 蛋白質(zhì)含量47
• 3.1.3.5 產(chǎn)率47-48
• 3.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)純品結(jié)構(gòu)及純度的影響48-51
• 3.1.4.1 粘度及分子量48-49
• 3.1.4.2 葡萄糖醛酸含量49
• 3.1.4.3 核酸OD值49-50
• 3.1.4.4 蛋白質(zhì)含量50-51
• 3.1.4.5 產(chǎn)率51
• 3.2 與傳統(tǒng)提純方法在純品結(jié)構(gòu)與純度上的比較51-61
• 3.2.1 與CTAB提純方法比較51-56
• 3.2.1.1 紅外光譜分析51-52
• 3.2.1.2 熱重分析52-53
• 3.2.1.3 葡萄糖醛酸含量53
• 3.2.1.2 粘度及分子量53-54
• 3.2.1.5 蛋白質(zhì)含量54-55
• 3.2.1.6 核酸OD值55
• 3.2.1.7 產(chǎn)率55-56
• 3.2.2 與氯苯酶解提純方法的比較56-61
• 3.2.2.1 紅外光譜分析56-57
• 3.2.2.2 熱重分析57
• 3.2.2.3 葡萄糖醛酸含量57-58
• 3.2.2.4 粘度及分子量58-59
• 3.2.2.5 蛋白質(zhì)含量59
• 3.2.2.6 核酸OD值59-60
• 3.2.2.7 產(chǎn)率60-61
• 3.3 體外HEK293細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-62
• 3.4 堿處理超濾法去除菌體的效果62-66
• 3.4.1 菌落圖62-64
• 3.4.2 堿處理超濾工藝去除SH粗品中添加的大腸桿菌效果64
• 3.4.3 堿處理超濾工藝去除SH粗品中添加的金色葡萄球菌效果64-66
• 3.5 堿處理超濾法去除病原體的效果66-75
• 3.5.1 兩種處理方法下純品中病原體情況66-67
• 3.5.2 半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）分析堿處理超濾法去除病原體67
• 3.5.3 q PCR分析堿處理超濾法去除病原體效果引物的設(shè)計(jì)和PCR67-75
• 第四章 結(jié)論與建議75-77
• 4.1 結(jié)論75-76
• 4.2 建議76-77
• 參考文獻(xiàn)77-85
• 附錄85-87
• 致謝87-88
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果88

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本文編號(hào)：1019981