【摘要】：睪酮是一種重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,外源性睪酮進入哺乳動物生物體內(nèi)之后能夠打破其體內(nèi)雌雄激素的穩(wěn)態(tài)平衡,從而影響機體正常的生長發(fā)育,能夠促進疾病甚至癌癥的發(fā)生。目前,睪酮的檢測主要集中于血清與尿液的檢查,而在水環(huán)境中睪酮的檢測研究較少。傳統(tǒng)的睪酮檢測方法雖然靈敏度較高、精度較好,但需要昂貴的檢測儀器以及高素質(zhì)操作人員,無法在保證精度情況下實現(xiàn)對睪酮的快速檢測。本研究基于納米金聚集的比色法技術,結合核酸適配體技術,開發(fā)出三種不同的快速檢測水環(huán)境睪酮的方法,結論如下:(1)開發(fā)了一種基于高濃度鹽離子聚集納米金和睪酮特異性適配體的比色法檢測睪酮的技術。高濃度鹽離子可以打破分散納米金顆粒的靜電平衡,促使納米金聚集。在最優(yōu)檢測條件下,檢測睪酮的檢測限為5.57 nM,檢測線性范圍為1000~2400 nM,對自來水的加標回收率為99.26~104.29%。(2)開發(fā)了一種基于陽離子聚合物聚集納米金和睪酮特異性適配體的比色法檢測睪酮的技術。陽離子聚合物能夠與適配體通過靜電作用形成復合物,同時也能打破分散納米顆粒的靜電平衡,促使納米金聚集。在最優(yōu)檢測條件下,該技術檢測睪酮的檢測限為2.3 nM,線性檢測范圍為2.27 nM~1.8μM,對自來水的加標回收率為99.81~105.04%。(3)開發(fā)了一種基于陽離子表面活性劑聚集納米金和睪酮特異性適配體的比色法檢測睪酮的技術。陽離子表面活性劑能夠與適配體形成超分子復合物,同時也能破壞納米金顆粒間的靜電平衡,使其發(fā)生聚集。在最優(yōu)檢測條件下,該技術檢測睪酮的檢測限為1.91 nM,線性檢測范圍為1.91~800 nM,對自來水的加標回收率為98.94~102.66%。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X832
【圖文】：

圖 1-1SELEX 篩選核酸適配體示意圖Fig.1-1 Systematic evolution of ligands by exponential enrichment process.3.2 核酸適配體篩選技術而在篩選過程中，篩選的成功與否取決于如何分離靶分子及與其結合的核子。常見的篩選方法主要有基于硝酸纖維膜過濾的 SELEX 技術、基于磁珠與色譜的 SELEX 技術、基于毛細管電泳技術的 SELEX 技術、基于微流控芯片ELEX 技術、Cell-SELEX 技術和其他 SELEX 技術。[1] 基于硝酸纖維膜過濾的 SELEX 技術硝酸纖維素膜經(jīng)常在蛋白雜交技術 Western blots 和原子力顯微鏡（atorce microscopy, AFM）被用于固定，因為它基于對氨基酸非特異性結合能夠簡快速的實現(xiàn)蛋白質(zhì)固定化。1968 年，Kramlova 團隊首次使用硝酸纖維素膜法和快速分離出 RNA 和蛋白質(zhì)[46]。這種方法已經(jīng)發(fā)展成為一種研究工具，用離固定蛋白質(zhì)和許多其他組分，然后將該蛋白質(zhì)可以與其他生物分子反應。ELEX 技術首次被 Gold 團隊建立，利用硝酸纖維素膜篩選得到 T4 DNA 聚合

就不能應用該方法。目前使用較多的是通過相互作用或化學反應來將靶標固定于磁珠上，由于磁珠具有強大的磁性，可以利用磁鐵實現(xiàn)快速分離固定了靶標的磁珠（圖1-2b,c）。最近，利用磁珠法 SELEX 篩選得到了針對不同靶標的大量核酸適配體[50-52]。該方法的缺點與親和層析法是類似的，若靶標不能被固定到磁珠表面，該方法不能使用。圖 1-2 (a) 親和色譜法篩選過程原理圖 (b) 磁珠法篩選過程圖 (c) 幾種不同（如磺基和環(huán)氧基）功能基團活化磁珠Fig.1-2 (a)A schematic illustration of the selection step from a library using an affinity column (b)The process of the selection step using magnetic beads (c) Several types of functionalgroup-activated beads such as tosyl-activated beads and epoxy-ac

上海交通大學碩士學位論文[3] 基于毛細管電泳技術的 SELEX 技術毛細管電泳（Capillary electrophoresis, CE）在速度、分辨率、容量和最小樣本稀釋方面比其他化學分析方法有許多顯著的優(yōu)點。如圖 1-3 所示，在電場的作用下，這種方法可以通過電荷、摩擦力和流體力學半徑來分離離子形式物質(zhì)，通過目標、庫和目標庫復合物之間的遷移率移位不同來篩選獲得核酸適配體。特別地是，相比其他技術，CE 技術最大的優(yōu)點是適配體能夠在很少的輪次就能篩選獲得，一般2~4 輪。Bowser團隊經(jīng)過僅四輪篩選就獲得了神經(jīng)肽 Y和 IgE 的核酸適配體[53,54]。

【參考文獻】

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本文編號：2746577