【摘要】：漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一種含有多個(gè)Cu~(2+)的多酚氧化酶,其廣泛存在于真菌、細(xì)菌、高等植物及昆蟲(chóng)中。漆酶可以催化芳香類(lèi)等物質(zhì)的降解,如木質(zhì)素、染料和農(nóng)藥等。由于一些環(huán)境化合物的氧化還原電勢(shì)高于漆酶,因此限制了漆酶的降解應(yīng)用。介體的發(fā)現(xiàn)使漆酶的作用范圍擴(kuò)大、降解速率提高,漆酶/介體系統(tǒng)(LMS)可以降解非酚類(lèi)及氧化還原電勢(shì)高的化合物,因此,漆酶在木質(zhì)素降解和環(huán)境污染物的降解等方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。本文以實(shí)驗(yàn)室野外采集的26種真菌菌株為材料,篩選獲得具有高效耐受農(nóng)藥的菌株(BUA-01),并以BUA-01為實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株,研究其菌株培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件、胞外漆酶分離純化、酶學(xué)特性和基因克隆以及LMS對(duì)污染物的降解應(yīng)用研究。具體內(nèi)容如下:1、以吡蟲(chóng)啉(0.5%)、乙酰甲胺磷(0.2%)、草甘膦異丙胺鹽(0.4%)和高效氯氰菊酯(2.2%)為作用靶標(biāo),對(duì)26種真菌開(kāi)展農(nóng)藥高耐受菌篩選,得到BUA-01菌株,其在上述四種農(nóng)藥培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率分別是6.75±0.25 mm/d、5.25±0.00 mm/d、3.25±0.13 mm/d和4.67±0.26 mm/d。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察及ITS分子鑒定,確定此菌株為毛栓菌(Trametes hirsuta);BUA-01最適培養(yǎng)條件:淀粉為最適碳源,黃豆粉和酵母浸粉為最適氮源,最適C/N比為40/1和10/1,最適溫度為37℃,最適pH為6.0-7.0,供試生長(zhǎng)因子對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著促進(jìn)作用;培養(yǎng)基中Cu~(2+)濃度為0.25 mmol/L,在培養(yǎng)96 h時(shí),發(fā)酵液的漆酶活性達(dá)到最高,是對(duì)照組的26倍,為1081.33±6.3U/mL;BUA-01菌株發(fā)酵液對(duì)偶氮染料降解效果顯著,12 h對(duì)依文思藍(lán)、甲基橙和鉻黑T的脫色率分別為93.31±0.16%、92.37±0.42%和79.25±0.64%。2、以5%的接種量將BUA-01菌株接種到終濃度為0.25 mM Cu~(2+)的發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)3 d后,獲得粗酶液。依次通過(guò)DEAE-Sepharose、SP-Sepharose和Q-Sepharose離子交換層析技術(shù),獲得電泳純級(jí)的漆酶(THL),經(jīng)SDS-PAGE,確定其分子量為67.7 kDa;以ABTS為作用底物時(shí),漆酶的最適溫度為60℃;最適pH為2.2;在溫度和pH分別在50-65℃和4.2條件下穩(wěn)定性較高;K_m與V_(max)分別為28.44μM和555.56μmol/min;10.0 mM Mg~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Cd~(2+)、Co~(2+)和EDTA對(duì)漆酶有顯著的抑制作用,抑制率25%-58%;而1.25 mM的Na~+對(duì)漆酶具有微弱激活作用,酶活提高10%左右;1.25-10.0 mM K~+對(duì)漆酶的活性無(wú)顯著影響。通過(guò)以簡(jiǎn)并引物對(duì)漆酶保守序列進(jìn)行擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)度為1226 bp的漆酶核心區(qū)cDNA部分序列,與T.hirsuta(KU878364.1)的相似性為97%,遺傳距離為0.072。3、LMS研究表明,該漆酶的最適介體為乙酰丁香酮(AS)和四甲基哌啶氮氧化物(TEM);LMS對(duì)堿性品紅、甲基橙、孔雀石綠和依文思藍(lán)降解效果最佳,24 h的降解率最高分別為72.3%、86.1%、88.2%和89.2%;全波段掃描結(jié)果表明,介體AS比介體TEM更具有提高漆酶反應(yīng)速率的能力,且THL-AS和THL-TEM在降解堿性品紅、甲基橙和依文思藍(lán)染料過(guò)程中均有新物質(zhì)生成;pH、溫度和介體濃度對(duì)LMS的影響表明,THL-AS在pH 2.0-5.0,20-60℃,介體濃度為0.1 mM的條件下非常穩(wěn)定,在1 h可實(shí)現(xiàn)對(duì)染料的高效降解,降解率可達(dá)80%左右;THL-TEM在pH 3.0-4.0,50-60℃,介體濃度為0.5-1.0 mM的條件下較為穩(wěn)定,但降解效率不如THL-AS高;在24 h時(shí),THL-TEM對(duì)乙酰甲胺磷的降解效果最好,為65.56%;THL-ABTS對(duì)黃曲霉毒素B_1的降解效果最好,為20.88%;LMS反應(yīng)液的10倍和50倍稀釋液對(duì)黑麥草具有低植物毒性,且隨著稀釋倍數(shù)的增加,對(duì)根長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響越小。
【圖文】：

漆酶活性中心結(jié)構(gòu)

化機(jī)制[17]. Substrate:底物；Substrate(+):底物chanism Substrate: Substrate; Substrate (+):Cupredoxin）型，具有三個(gè)部分的結(jié)子的特點(diǎn)。Ducros 從灰蓋鬼傘（Cop-Cc 的結(jié)構(gòu)（PDB 注冊(cè)號(hào) 1A65, 圖 1-
【學(xué)位授予單位】：北京農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2588221