本文關(guān)鍵詞： DEHP Gordonia sp.HS-NH1 pht基因簇 HPLC　出處：《華中師范大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：鄰苯二甲酸二(2乙基己基)酯(DEHP)屬于鄰苯二甲酸酯類(PAEs,又名酞酸酯),是一種環(huán)境激素類化合物。DEHP廣泛應用于食品包裝材料、化妝品、農(nóng)藥、醫(yī)療器械、以及兒童玩具等領(lǐng)域,是一種廣泛應用的增塑劑。DEHP在塑料制品中不以共價鍵連接,因此極易從塑料中脫離進入環(huán)境,目前已經(jīng)廣泛存在于土壤,水體以及大氣等外界環(huán)境中。DEHP具有生物富集作用,且對有機體造成生殖毒性,神經(jīng)毒性,及多器官癌變等傷害,因此被美國環(huán)保局(EPA)列入優(yōu)先控制有毒污染物的行列。環(huán)境中的DEHP可通過生物和非生物兩種主要方式降解,其中微生物降解是最主要的降解方式。目前關(guān)于DEHP微生物降解的研究主要集中在降解菌的篩選,鑒定及其降解特性分析,而關(guān)于DEHP的代謝途徑及其功能基因的研究卻很罕見。本文從長期受生活污水污染的湖北省武漢市南湖底泥中分離篩選得到一株高效DEHP降解菌HS-NH1,經(jīng)鑒定是戈登氏菌(Gordonia sp.),并對其進行降解特性、代謝途徑及其部分功能基因研究。戈登氏菌屬(Gordonia sp.)是一類重要的環(huán)境污染物降解菌,而關(guān)于Gordonia sp.對DEHP的降解機制的研究卻很罕見。本研究通過富集培養(yǎng)法篩選得到4株DEHP降解菌,經(jīng)梯度馴化發(fā)現(xiàn)一株降解效率高,底物范圍廣的DEHP降解菌,命名為HS-NH1。通過16SrRNA和gyrB基因同源序列分析及分子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,結(jié)合形態(tài)學觀察和生理生化實驗,初步鑒定該菌為戈登氏菌(Gordonia sp.)。Gordonia sp.HS-NH1的最適生長和降解溫度為30℃、pH值為7.0,最適條件下,該菌株能夠在60h內(nèi)將500mg/LDEHP降解90%以上。底物廣譜性試驗證明,Gordonia sp.HS-NH1能夠有效地利用多種常見的鄰苯二甲酸酯(PAEs)及其代謝產(chǎn)物,如鄰苯二甲酸丁基芐基酯BBP、鄰苯二甲酸二辛酯DOP、鄰苯二甲酸二丁酯DBP、鄰苯二甲酸二乙酯DEP、鄰苯二甲酸二甲酯DMP、鄰苯二甲酸PA、原茶兒酸PCA等。本文通過高效液相色譜(HPLC)檢測DEHP的代謝產(chǎn)物,在DEHP降解初期,鄰苯二甲酸(PA)大量積累,并隨著降解時間的延長而逐漸減少。結(jié)果表明PA是DEHP降解的重要代謝產(chǎn)物,且PA的降解也是DEHP徹底降解的關(guān)鍵步驟,因此Gordoniasp.HS-NH1中PA降解相關(guān)基因的分離和鑒定是探究DEHP具體代謝途徑的必要環(huán)節(jié)。本文對Gordoniasp.HS-NH1進行基因組掃描分析,得到5073開放閱讀框,并對其基因注釋和基因功能分類,發(fā)現(xiàn)DEHP降解相關(guān)基因有鄰苯二甲酸酯水解酶基因,MEHP水解酶基因,鄰苯二甲酸降解基因簇(pht基因簇,包括基因phtAa、phtAb、phtAc、phtAd、phtB、phtC、phtR),原兒茶酸降解基因簇(pcm基因簇,包括基因pcmF、pcmR、pcmD、pcmH、pcmG、pcmB 和pcmL),ABC 轉(zhuǎn)運蛋白基因簇(ptr基因簇,包括ptrB、ptrD和ptrA),MFS轉(zhuǎn)運蛋白基因等遺傳單位,并對其進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)這些遺傳單位與NCBI中其他DEHP降解菌中的相應基因都具有同源性。其中pht基因簇負責DEHP重要中間代謝產(chǎn)物PA的降解,其編碼的氨基酸序列分別與其他菌株的3,4-鄰苯二甲酸雙加氧酶大亞基(phtAa)、3,4-鄰苯二甲酸雙加氧酶小亞基(phtAb)、3,4-鄰苯二甲酸雙加氧酶鐵氧還蛋白亞基(phtAc)、3,4-鄰苯二甲酸雙加氧酶鐵氧還蛋白還原酶亞基(phtAd)、3、4-二氫二羥鄰苯二甲酸脫氫酶(phtB)、3、4-二羥鄰苯二甲酸脫羧酶(phtC)和調(diào)控蛋白(phtR)的氨基酸序列具有高度的相似性。反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示,Gordnia sp.HS-NH1中的pht基因簇形成一個操縱子,由PA誘導共同轉(zhuǎn)錄。本文通過PCR技術(shù)分離得到pht基因簇的基因片段:phtAab、phtAcd、phtB、phtC、通過分子克隆技術(shù)將這些基因亞克隆到pET-28a中,構(gòu)建重組表達載體pET-phtAcd、pET-phtB和pET-phtC,并將重組表達載體轉(zhuǎn)入受體細胞E.coliBL21中,構(gòu)建重組菌。SDS-PAGE分析重組菌的誘導表達產(chǎn)物,結(jié)果顯示含有重組質(zhì)粒pET-phtAab的重組菌表達大小約為53-kDa、22-kDa的兩個蛋白;含有重組質(zhì)粒pET-phtAcd的重組菌表達大小約為7-kDa、43-kDa的兩個蛋白;含有重組質(zhì)粒pET-phtB的重組菌表達大小約為30-kDa的蛋白;含有重組質(zhì)pET-phtC的重組菌表達大小約為25-kDa的蛋白,這些蛋白大小與生物軟件(DNAMAN7.0)根據(jù)氨基酸序列預測的大小基本一致。HPLC檢測表達產(chǎn)物催化活性,結(jié)果顯示PA在phtAab、phtAcd的表達產(chǎn)物共同催化下轉(zhuǎn)化成3,4-二氫二羥鄰苯二甲酸,后者在phtB、phtC的表達產(chǎn)物共同催化下轉(zhuǎn)化成原兒茶酸。因此可以推測DEHP的代謝途徑是:DEHP在鄰苯二甲酸酯水解酶的作用下水解產(chǎn)生鄰苯二甲酸,鄰苯二甲酸在pht基因簇表達的多種酶作用下形成原兒茶酸,原兒茶酸最終在多種酶作用下形成CO_2和H_2O。綜上所述,Gordoniasp.HS-NH1是一株降解效率高,底物范圍廣的DEHP降解菌,Gordonia sp.HS-NH1基因水平的研究為深入理解其降解途徑,提高其降解效率,擴大其降解污染物范圍奠定基礎(chǔ)。
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【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X172

【參考文獻】

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本文編號：1474974