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低溫微生物

34　　　　　　　　　　　東　北　林　業(yè)　大　學　學　報　　　　　　　　　　　　　　　第31卷

和β-半乳糖苷酶等幾種耐冷酶的基因已經被克隆并序列

化[12～15]。日本的Murata[16]的研究小組證實了藍細菌C12去飽和酶的活性和耐冷菌在低溫下生長之間的關系,他們從耐冷菌Synechocystis還克隆了C12去飽和酶desA基因,并且把它轉到常溫菌Anacystisnidulans中,使它具有活性去合成飽和脂肪酸(主要是C9、C12),同時能適應低溫環(huán)境。甲苯降解質粒從嗜熱菌P.putide中轉移到耐冷菌P.putide中后,甲苯降解基因在低溫下能夠表達,在0℃可以生物降解甲苯[17]。至今為止,分子生物學研究的方向是分離出足夠的蛋白,測序并進行蛋白晶體的研究。關于耐冷蛋白的生成和翻譯規(guī)則方面還有待進一步的研究。4.2　冷激蛋白

,即一種。[突然轉移到10℃時,會產CSPA,它結合于本,作為轉座因子對冷誘導基因的表達起作用。在其它細菌中已經發(fā)現了它的同源蛋白,主要是在B.subtilis中發(fā)現的CspB蛋白,與CSPA有61%的相似性[19]�，F已發(fā)現冷休克蛋白在原核和真核微生物中普遍存在,冷刺激的幅度越大產生的冷休克蛋白就越多。Ray[20]等以大腸桿菌的CSPA為探針,檢測了分離自南極的耐冷菌中冷休克基因的存在及表達,發(fā)現有些耐冷菌在22℃和4℃時冷休克基因能經常表達,有些耐冷菌當溫度從22℃突然降到4℃,1h后CSPA表達量最大。

除冷刺激蛋白之外,還存在第二類蛋白,稱為冷適應蛋白CAPS,同冷刺激蛋白相比,CAPS在低溫環(huán)境中是對應溫度生長速度連續(xù)合成的。耐冷菌由于生活在溫度波動的環(huán)境中,它們必須忍受溫度的快速降低,這與它們生產的冷休克蛋白是密切相關的。冷休克蛋白不僅在原核生物和真核生物中廣泛存在,并且發(fā)現它與真核生物的DNA結合蛋白具有很高的相似性。其詳細功能有待于進一步闡明。在冷適應期間,至少有15種不同的冷休克蛋白被誘導合成。

明顯是嗜冷性的,它在15℃以上失活,而當溫度降至0℃時又

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快速恢復活性。此外,溫度還通過影響核糖體上蛋白質的翻譯速率或是通過影響某種專一mRNA翻譯的起始或翻譯的速率,來影響合成蛋白總量或特定蛋白的相對量[5]。Kra2jewska和Szer[6]證實:在嗜冷性假單孢桿菌中蛋白合成同中溫菌和嗜熱菌相比,在同樣低溫下有非常低的錯配率。因此很明顯,低溫菌的一個適應性就是在它們的翻譯機理中,具有在低溫下保持有效啟動的特殊能力,而在中溫菌和嗜熱菌系統中沒有。

據報道,當嗜冷性微生物生長在它們底線溫度時,蛋白質含量增多。Vckovski[7]的研究組用中溫菌E.coli通過放射性標記細胞蛋白來判斷生長在不同溫度下的細胞蛋白的分離程度,發(fā)現當生長溫度接近上限和下限時,蛋白組成有一些差異。這些蛋白在生長范圍的中間部分是很穩(wěn)定的,但當溫度接近13.5℃和46℃時,蛋白質水平有所改變。

3　冷活性酶

,酶的作用。,而來。研究冷活性酶最早的是Morita,他報道了海產弧菌蘋果酸脫氫酶在低于20℃時具有催化活性,溫度超過20℃時則很快失活[8]。中科院從南極的嗜冷酵母中分離純化的琥珀酸脫氫酶,其最適反應溫度為20℃,在0℃能保持最大活性的60%。但當溫度升高時冷活性酶即表現出對熱的敏感性。如海洋弧菌細胞中的蘋果酸脫氫酶于30℃處理10min,酶活力完全喪失;丙酮酸脫羧酶在35℃處理30min,酶活力損失90%[9]。

通過對淀粉酶、乳糖脫氫酶、脂酶和枯草桿菌蛋白酶等冷活性酶的空間結構和來自中溫菌的相應酶進行比較,發(fā)現冷活性酶的分子適應機制似乎是氨基酸殘基之間相互作用較弱,從而形成較伸展的分子結構,這種結構可在低耗能的情況下發(fā)揮催化作用[10]。Zuber{7}及其同事從耐冷菌Bacilluspsychrosaccharolyticus中分離出乳酸脫氫酶(LDH),隨后進行了克隆及序列化,并將耐冷乳酸脫氫酶基因序列同中溫菌、嗜熱菌比較,證明耐冷LDH具有更多的極性、帶電殘基、更多的疏水表面及離子配對殘基,這些變化使酶的活性中心更具柔韌性,并且在低溫下更穩(wěn)定。Gerday[11]的課題組對耐冷淀粉酶、蛋白酶和脂酶進行了分析,并同相應的中溫序列進行比較,得到了相同的結果。

辛明秀[7]等認為嗜冷菌細胞中的代謝酶類在低溫(0～)范圍內表現出最大活性,與中溫菌的相對酶類比較,嗜30℃

冷菌細胞中的代謝酶類在溫度活性范圍內偏向低溫,如嗜冷酵母的己糖激酶、醛縮酶和琥珀酸脫氫酶與中溫的釀酒酵母細胞中同類酶相比,其最大活性溫度分別降低5、5～10和20℃,嗜冷菌細胞中的有些代謝酶類在低溫下具有較強的底物親和力。

自然環(huán)境中的大多數生物轉化發(fā)生在相對低溫下,因此低溫菌群代表了一種潛在的酶資源,它在低溫生物技術工藝上比中溫酶和嗜熱酶發(fā)揮更有效的作用。

5　冷適應微生物在環(huán)境工程中的應用

在地球上,冷環(huán)境占據很大面積,即使在熱帶地區(qū),其冬天溫度也較低。冷適應微生物在自然界中的分布十分廣泛,其溫度適應范圍是0～30℃,與許多環(huán)境污染物所處的溫度大致相同,因此在低溫環(huán)境中,它們對于有機污染物的降解起到了十分重要的作用。Cooney分析了3個淡水湖中影響烴類降解的因素,認為溫度的降低抑制了烴類的降解。Atlas分析了北極海洋冰層、水和沉積物生態(tài)系統中生物間的相互影響,認為低溫下的北極海洋冰層中的生物降解是可以忽略的。但以后的研究者應用人工篩選出的具有降解能力的耐冷微生物,經實驗證實,在低溫條件下絕大部分有機物均可被耐低溫的微生物降解。

Chevalier[21]從南極和北極分離到4株耐冷的絲狀藍細菌Cyanobacteria,它們在低溫下對氮和磷有較高的去除率。At2lasBossert和Leahy[22]從土壤、淡水和海洋系統中分離的微生物能廣譜利用自然環(huán)境中存在的各種石油烴類污染物,并將其作為唯一的能源和碳源.Whyte[23]分離了Rhodococcussp.Q15菌株,這種菌在0℃和5℃條件下能高效降解多種短鏈烷烴及十六烷、二十八烷、三十二烷等。Jarvinen[24]等進行了氯酚類的生物降解研究,他們從地下水中分離到的耐冷高效氯

4　嗜冷菌的分子生物學研究

4.1　基因的克隆

同嗜熱菌相比較,對嗜冷菌的分子基因研究很少。耐冷性酶α-淀粉酶、蛋白酶、脂酶、乳酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶

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