【摘要】：研究背景隨著我國經(jīng)濟和人民生活水平提高,交通意外傷及建筑工人意外導致的骨折發(fā)病率逐年遞增,各種類型的骨折其治療方式不盡相同,但最終治療的目的為恢復骨折斷端的連續(xù)性和骨的穩(wěn)定性。影響骨折愈合的因素很多,例如特殊部位的骨折或嚴重的開放性骨折,通常會伴隨骨折斷端血管及神經(jīng)的副損傷,在骨折修復過程中,骨折斷端周圍的缺血、缺氧和周圍組織的炎癥反應,均會影響骨折愈合的時間和程度,臨床也經(jīng)常出現(xiàn)骨折斷端周圍環(huán)境缺氧和炎癥反應而未及時處理導致骨折愈合不良,延遲愈合或者是骨折不愈合,不但會給患者帶來不必要的痛苦,也會給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔,因此,研究骨折不愈合的因素,如何人為地從外界通過藥物或手術(shù)干擾促進骨折愈合成為臨床急需解決的問題。通常狀態(tài)下,骨折斷端周圍血管的損傷或者是新生骨痂周圍血管再生被抑制,均會導致斷端缺血缺氧,從而抑制骨折愈合；而在缺氧環(huán)境下骨折斷端周圍釋放的缺氧誘導因子、血管內(nèi)皮生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等可以促進骨折愈合。有研究通過骨折固定術(shù)后周圍組織注射血管內(nèi)皮生長因子來提高骨折愈合的比率,但由于血管內(nèi)皮細胞生長因子價格昂貴,或者還需要其他療法的參與,因此難以在臨床中實施。另外有研究發(fā)現(xiàn),嚴重創(chuàng)傷會導致局部或全身的炎癥反應。而在創(chuàng)傷愈合與骨折愈合過程中各種免疫細胞激活,細胞因子被釋放,激活的細胞和釋放的因子均參與到骨折愈合的各個階段,在骨折愈合的早期,免疫細胞就已經(jīng)開始滲入到骨折斷端血腫內(nèi)。在骨折早期,缺氧就可以導致白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)上調(diào),從而調(diào)節(jié)骨折斷端周圍的微環(huán)境。但是對于骨折愈合過程中的炎癥反應機制目前尚不清楚。研究表明,在全身敗血癥動物模型中,高遷移組蛋白B1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1)是最早被確認的缺氧類因子。至今學術(shù)界認為,高遷移率族蛋白B1是多種損傷模型例如肺損傷、肝臟局部缺血再灌注、失血性休克等關(guān)鍵的炎癥因子,高遷移率族蛋白B1與Toll樣受體(toll-like family of receptors, TLRs)結(jié)合啟動損傷最初的炎癥反應,然而對于高遷移率族蛋白B1在骨折愈合中對于炎癥反應的應答作用機制尚不清楚。另外骨形態(tài)發(fā)生蛋白尤其是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨鈣蛋白可以在一定程度上緩解低氧對于骨間充質(zhì)干細胞修復骨折的影響,但是長期的缺氧將會導致成骨細胞和骨間充質(zhì)干細胞的凋亡甚至壞死。此外許多研究表明,N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)是在醫(yī)療器械上使用的安全的具有生物活性藥物,尤其是近年來有報道,在體內(nèi),N-甲基吡咯烷酮對于兔顱骨損傷具有一定的促進骨化和修復的作用,因此N-甲基吡咯烷酮可能對骨質(zhì)疏松、骨折愈合或者其他骨量丟失的疾病具有一定的療效。也有研究表明,N-甲基吡咯烷酮具有一定的抗炎作用,其能與脂多糖結(jié)合抑制炎癥過程。N-甲基吡咯烷酮能夠抑制炎癥中脂多糖導致的TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS和COX-2等炎癥因子的生成,其主要是通過降低NF-κ B信號途徑發(fā)揮抑制炎癥因子生成的作用。因此本文分別通過兩個方面研究缺氧狀態(tài)下可能影響骨折愈合的信號通路,首先我們通過在缺氧狀態(tài)下骨折斷端血腫細胞中和巨噬細胞檢測高遷移率族蛋白B1水平,并研究高遷移率族蛋白B1在常氧和缺氧環(huán)境中如何激發(fā)Toll樣受體的信號過程促進成骨細胞中的增殖規(guī)律。同時我們對在常氧和缺氧環(huán)境下檢測了成骨細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinsaes. ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化,并將xx-特異性的siRNA轉(zhuǎn)染到缺氧環(huán)境中的成骨細胞,并用高遷移率族蛋白B1干擾,檢測了細胞增殖特性和ERK/JNK的磷酸化。研究的第一部分主要探討低氧下,通過TLR-4信號通路高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)影響ERK/JNK磷酸化和成骨細胞分化增殖的機制。第二部分我們要研究N-甲基吡咯烷酮在低氧環(huán)境下對成骨細胞凋亡和分化的作用,并且從分子水平分析N-甲基吡咯烷酮對成骨細胞作用的相關(guān)機制,本文的成果可能解釋N-甲基吡咯烷酮可能促進低氧環(huán)境中成骨細胞增殖分化修復骨折的能力,也為探索骨折不愈合的機制,研制治療骨不連的藥物提供分子生物學基礎(chǔ)。研究目的1、探討低氧下,通過TLR-4信號通路高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)影響ERK/JNK磷酸化和成骨細胞分化增殖的機制,為臨床骨不連的治療提供分子生物學基礎(chǔ)理論。2、探討低氧下,通過NF-κB信號通路N-甲基吡咯烷酮(NMP)影響成骨細胞分化的機制,為N-甲基吡咯烷酮的臨床應用提供分子生物學基礎(chǔ)。研究方法第一部分：1.樣本的制備及分組選自2014年3月至2015年3月來自于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科31例股骨干骨折病例,在手術(shù)前經(jīng)患者簽署知情同意書,經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會倫理審核后,在手術(shù)中獲取骨折周圍血腫樣本和新鮮血液樣本。在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織細胞淋巴瘤細胞U937細胞,并在培養(yǎng)中加入10%或2%的小牛血清,50μg/ml的青霉素和50μg/ml的鏈霉素,先對細胞進行離心分離按照1-2×105活細胞/mL再懸浮,每三到四天更換新的培養(yǎng)液(依據(jù)細胞生長的密度)。在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)MG-63細胞,并在培養(yǎng)中加入10%的小牛血清,50μg/ml的青霉素和50μg/ml的鏈霉素,將兩類細胞在5%CO2,在37℃的環(huán)境下放置于細胞培養(yǎng)皿上。低氧環(huán)境造模方法,將細胞在5%CO2和氮氣及2%的氧氣混合氣體中培養(yǎng)。在高遷移率族蛋白B1檢測試驗中,將組織細胞淋巴瘤細胞U937細胞放置于常氧和低氧環(huán)境中培養(yǎng)8,12和24小時,然后將懸浮組織細胞淋巴瘤細胞U937細胞收集,并進行高遷移率族蛋白B1的檢測。在RPMI-1640 (2% FBS)上培養(yǎng)85-95%細胞融合度的MG-63細胞,在常氧和低氧環(huán)境下混合0,0.2或者1μg/mL高遷移率族蛋白B1培養(yǎng)24,48和72小時；將siRNA-TLR-4和control siRNA混有30和60 nM脂質(zhì)體2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)轉(zhuǎn)染MG-63細胞造模敲除MG-63細胞的TLR-4。2.高遷移率族蛋白B1的酶聯(lián)免疫吸附試驗為了檢測骨折斷端血腫樣本和新鮮血液樣本中以及巨噬細胞U937的高遷移率族蛋白B1的水平,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗說明書的步驟進行操作檢測,實驗板孔中連續(xù)滴加100μL標準液和樣本,并在37℃環(huán)境下孵育2小時,然后吹吸樣本,然后用100μ混有PBST的磷酸鹽溶液沖洗四次,然后將100μL高遷移率族蛋白B1抗體加入孔中,37攝氏度下孵育一小時,沖洗四次,每孔再加入100μL螯合有辣根過氧化物酶的二抗37攝氏度下孵育30分鐘,在黑暗環(huán)境下每孔加入100μL的終止液并放置15分鐘,封板后在450nm酶標儀中測量數(shù)據(jù)。3.mRNA的提取和定量分析MG-63的nRNA用TRizol reagent試劑盒進行提取,mRNA的含量用實時定量PCR儀進行測量,MG-63細胞中的ERK,JNK, TLR-Tubulin的mRNA含量用SYBR Green PCR Kits試劑盒進行定量檢測,定量聚合酶鏈反應(quantitativepolymerase chain reaction, qPCR)過程在ABI PRISM 7300檢測系統(tǒng)中進行,引物鏈是由上海生工公司合成,所有的檢測都是利用AACt方法,檢測結(jié)果都是待檢物和內(nèi)參比較的倍數(shù)。4.免疫印跡實驗利用NE-PER細胞核和細胞質(zhì)抽提檢測試劑盒抽提細胞溶質(zhì)和細胞核蛋白,利用蛋白酶抑制劑雞尾酒試劑盒進行蛋白增補,10%或12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本,再將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,然后將膜用2%BSA封閉,4攝氏度下過夜,然后轉(zhuǎn)移到非特異性結(jié)合膜,用兔多克隆IgG結(jié)合高遷移率族蛋白B1、ERK磷酸化或非磷酸化Thr202/Thr204, JNK磷酸化或非磷酸化Thr183,TLR-4和微管蛋白,用電化學發(fā)光法檢測特異性結(jié)合,高遷移率族蛋白B1或TLR-4的含量水平用相對于微管蛋白的灰度值表示,p-ERK或p-JNK的結(jié)果用相對于ERK、JNK的灰度值表示。5.CCK-8的細胞增殖實驗MG-63在常氧和缺氧環(huán)境下的增殖測量,以及MG-63細胞在高遷移率族蛋白B1處理或未處理,或者MG-63細胞轉(zhuǎn)染siRNA-TLR-4和siRNA-Con的增殖測量都用CCK-8實驗的方法測量。其測量方法簡言之,就是每組MG-63細胞與CCK-8共培養(yǎng),在490nm,檢測各類樣本的吸光度。第二部分：1.細胞培養(yǎng)人類成骨細胞hFOB 1.19在1：1混合Ham's F12的基質(zhì)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)培養(yǎng)液中培養(yǎng),培養(yǎng)液中添加2.5 mM左旋谷酰胺和0.3mg/ml G418 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA),并且添加10%小牛血清hFOB 1.19細胞在5% CO2,37℃環(huán)境下溫箱中培養(yǎng)。低氧環(huán)境造模方法,將細胞在5% CO2和氮氣2%的氧氣混合氣體中培養(yǎng)。持續(xù)監(jiān)測氧的濃度,N-甲基吡咯烷酮分別配成0,3,10和30 mM濃度的溶液與成骨細胞混合。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測BMP-2, PINP, ALP和RUNX-2檢測人類成骨細胞hFOB 1.19 cells中細胞內(nèi)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,骨膠原前肽I(propeptide of type I procollagen I, PINP)、堿性磷酸酶和成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子-2(Runt-related transcription factor-2, RUNX-2)表達水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測,全部檢測步驟參照相應的試劑說明書。培養(yǎng)板上對照孔連續(xù)滴加100μL標準液和hFOB 1.19細胞,4℃下過夜培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)盤中滴加100μL抗體溶液(抗BMP2, PINP, ALP和RUNX2),37℃下培養(yǎng)1小時,然后加入100μL辣根過氧化物酶二抗37℃下培養(yǎng)半小時,在每次孵育前,用添加PBST的磷酸鹽緩沖劑清洗培養(yǎng)板四次,最后在培養(yǎng)板上滴加100 μL終止液,暗室中放置15分,在450 nm下用分光光度計檢測其濃度。3.利用RT-qPCR法檢測p65 mRNA,用熒光素酶報告實驗檢測NF-κB依據(jù)產(chǎn)品說明書,用Total Nucleic Acid Isolation Kit試劑盒提取hFOB 1.19的mRNA,最后添加1μl RNasin(?) Plus RNase的終止液,用Takara One Step RT-PCT kit檢測p65 mRNA的含量,通過p65-特異性引物(正：5'-tgatcactaagcaggaagatgtg-3',反：5'-gaaggctcaggtcggccccag-31).利用AACt法定量測量p65比β-actin的相對量ohFOB 1.19細胞移植到96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)至85%細胞融合度,hFOB 1.19細胞用NF-κB熒光素酶轉(zhuǎn)染,依據(jù)Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)檢測系統(tǒng)的說明書檢測轉(zhuǎn)染后的NF-κB的濃度。4.蛋白分離和免疫印跡實驗利用Nuclear/Cytosol Fractionation Kit試劑盒,參照其說明書對5×105 hFOB1.19細胞進行蛋白提取,分別對細胞核和細胞質(zhì)中的溶解物進行提取,并加入蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),用 BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)試劑盒定量檢測細胞核和細胞質(zhì)中溶解物。利用12% SDS-PAGE梯度凝膠分離待檢蛋白p65和IκB,然后轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維膜上,為了阻斷特異性結(jié)合部位,用兔多克隆抗體與p65, IκB和內(nèi)參β-actin結(jié)合,2%BSA孵育硝酸纖維素膜(4℃過夜),然后辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗羊抗兔抗體室溫下進行孵育1小時,每次孵育前都要用l×磷酸Phosphate Buffered Saline Tween-20 (PBST)沖洗三次,p65, IκB和β-actin蛋白含量用增強化學免疫熒光法進行檢測。5.MTT法檢測細胞活力用MTT法檢測hFOB 1.19細胞活力,以下簡單描述MTT法,hFOB 1.19細胞在常氧,低氧及合并N-甲基吡咯烷酮的作用下與MTT試劑37℃下孵育3小時,在450 nm下用分光光度計測量其濃度,結(jié)果用OD450值表示。統(tǒng)計分析全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用t檢驗,檢驗水準設(shè)置為0.05,當P0.05時兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果第一部分：1.在低氧環(huán)境中骨折斷端血腫標本、巨噬細胞U937中高遷移率族蛋白B1含量上調(diào)。為了研究在骨折過程中高遷移率族蛋白B1的作用,我們首先在骨折斷端血腫中檢測了高遷移率族蛋白B1的含量,其中骨折斷端血腫標本來源于臨床股骨干骨折的手術(shù)治療患者,另外我們選取了相同病患的新鮮血液標本作為對照組,結(jié)果骨折斷端血腫標本中高遷移率族蛋白B1的含量為(31.730±3.197)ng/mL,遠高于新鮮血液標本中高遷移率族蛋白B1的含量(9.845±0.967 ng/mL),經(jīng)檢驗P0.0001,差異具有統(tǒng)計學意義。接著我們研究了缺氧下人類巨噬細胞中高遷移率族蛋白B1的含量,其中巨噬細胞是高遷移率族蛋白B1的主要來源細胞。缺氧處理12小時到48小時,與相同時間常氧狀態(tài)下比較,U937巨噬細胞高遷移率族蛋白B1的水平上調(diào)。同時我們也測量了U937細胞在常氧和缺氧環(huán)境下細胞核和細胞質(zhì)中高遷移率族蛋白B1的分布,細胞核中的高遷移率族蛋白B1在常氧和缺氧環(huán)境中無差異,然而,在細胞質(zhì)中,缺氧環(huán)境下,高遷移率族蛋白B1的含量上調(diào)。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)24和48小時,細胞質(zhì)/細胞核中的高遷移率族蛋白B1的比值上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義。2.高遷移率族蛋白B1促進成骨細胞MG-63增殖并且上調(diào)TLR-4。將0、0.2和1μg/mL三種濃度的高遷移率族蛋白B1加入MG-63的培養(yǎng)皿,檢測其生長曲線。我們發(fā)現(xiàn),在常氧環(huán)境下,0.2μg/mL的高遷移率族蛋白B1可以使MG-63細胞增殖水平增高,而1μg/mL高遷移率族蛋白B1促進MG-63細胞增殖水平最高,以上研究均說明,在常氧環(huán)境下高遷移率族蛋白B1對于MG-63具有促進其增殖的作用,同樣在缺氧環(huán)境中高遷移率族蛋白B1對于MG-63也具有促進其增殖的作用,差異有統(tǒng)計學意義(見圖1-5,表1-3)。0.2μg/mL高遷移率族蛋白B1處理MG-63細胞24,48,72小時后,可以顯著性的抑制該細胞的活性下降。同時我們檢測了在常氧和缺氧狀態(tài)下高遷移率族蛋白B1干擾MG-63細胞中TLR-4的水平。免疫印跡反應結(jié)果顯示,特別是在對MG-63細胞施以0.2μg/mL高遷移率族蛋白B1干擾后,在缺氧狀態(tài)下MG-63細胞中TLR-4水平顯著性提高。因此在缺氧狀態(tài)下,高遷移率族蛋白B1可以促進MG-63細胞的增殖,并且使TLR-4水平上調(diào)。3.高遷移率族蛋白B1誘導MG-63細胞中ERK和JNK的磷酸化。在常氧和缺氧狀態(tài)下利用高遷移率族蛋白B1干擾MG-63細胞后測量ERK和JNK的磷酸化和表達水平。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)MG-63細胞12小時后,ERK的mRNA水平顯著性增高,高遷移率族蛋白B1(0.2μg/mL)干擾還會促使ERK的mRNA水平進一步增高,且增高水平持續(xù)到干擾后24小時。在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)MG-63細胞12小時后,JNK的mRNA水平顯著性增高。缺氧處理MG-63后ERK和JNK的磷酸化水平顯著性升高,組間差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05或p0.01)。且缺氧處理MG-63并用高遷移率族蛋白B1干擾后,ERK和JNK的磷酸化水平還會繼續(xù)升高,差異具有統(tǒng)計學意義。(p0.01)。以上研究結(jié)果說明高遷移率族蛋白B1誘導MG-63細胞中ERK和JNK表達水平增加和磷酸化。4.MG-63細胞TLR-4低表達后可以抑制高遷移率族蛋白B1促進MG-63細胞增殖的作用。利用TLR-4-特意的siRNA在常氧環(huán)境下使MG-63細胞的TLR-4的表達沉默,用30或60 nM siRNA-TLR-4對MG-63細胞進行敲除,兩組的TLR-4 mRNA水平從分別從(1.00±0.12)和(1.00±0.13)降到(0.53±0.058)和(0.32±0.037),均為p0.01,差異具有統(tǒng)計學意義(見圖1-13)。另外與對照組siRNA-Con相比較,siRNA-TLR-4轉(zhuǎn)染MG-63細胞后置于缺氧環(huán)境中24、48小時會明顯抑制MG-63中TLR-4的表達生成(p0.05或p0.01)。然后用60 nM siRNA-TLR-4和siRNA-Con轉(zhuǎn)染MG-63細胞后置于缺氧和常氧環(huán)境下,我們繪制MG-63細胞的生長曲線。結(jié)果顯示與對照組siRNA-Con相比較, siRNA-TLR-4轉(zhuǎn)染MG-63細胞后在常氧環(huán)境中24、48、72小時會明顯抑制MG-63細胞的增殖水平(p0.05或p0.01,見圖1-15)。另外與對照組siRNA-Con相比較,siRNA-TLR-4轉(zhuǎn)染MG-63細胞后會明顯降低MG-63細胞的活性(p0.05或p0.01,見圖1-16)。綜上所述,高遷移率族蛋白B1在常氧環(huán)境下促進MG-63細胞增殖的作用依賴TLR-4,或者說高遷移率族蛋白B1可以介導提高在低氧環(huán)境下MG-63的細胞活力。5.TLR-4低表達后降低了MG-63細胞中,高遷移率族蛋白B1-誘導的ERK和JNK磷酸化。通過免疫印跡實驗檢測通過60 nM siRNA-TLR-4和對照組siRNA-Con轉(zhuǎn)染的MG-63細胞中ERK和JNK磷酸化水平。與對照組siRNA-Con相比,轉(zhuǎn)染siRNA-TLR-4后24或48小時,可以顯著地抑制低氧誘導的ERK磷酸化(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。同樣轉(zhuǎn)染60 nM siRNA-TLR-4后,可以顯著地抑制低氧誘導的JNK磷酸化(p0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。因此我們認為,低氧環(huán)境下,TLR-4的低表達降低了MG-63細胞中高遷移率族蛋白B1-誘導的ERK和JNK磷酸化水平。第二部分：1.低氧誘導成骨細胞分化標志蛋白下調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨膠原前肽Ⅰ,堿性磷酸酶和RUNX2蛋白的高表達是成骨細胞分化增殖的特征性標志。為了驗證以上結(jié)果,我們首先利用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量在常氧和低氧狀態(tài)下hFOB 1.19細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨膠原前肽Ⅰ、堿性磷酸酶和RUNX2蛋白的表達情況。在hFOB 1.19細胞中,在各個時間段,缺氧環(huán)境中BMP-2的表達量顯著性低于常氧狀態(tài)(p0.05或p0.01處理后6,12或24小時)。缺氧環(huán)境中PINP、ALP、RUNX2的表達量顯著地低于常氧狀態(tài)(p0.05或p0.01處理后6、12或24小時)。2.低氧誘導的成骨細胞去分化激活NF-κB信號低氧能夠在神經(jīng)元、T淋巴細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和各類的腫瘤細胞介導NF-κB通路。我們在常氧和低氧狀態(tài)下培養(yǎng)hFOB 1.19細胞0、 6、12或24小時,通過在hFOB 1.19細胞內(nèi)激活NF-κB通路,低氧環(huán)境中的hFOB 1.19細朐p65 mRNA表達水平增高(p0.01或p0.001)。免疫印跡技術(shù)定性分析實驗也證明,低氧環(huán)境中處理hFOB 1.19細胞12或24小時后,hFOB 1.19細胞p65蛋白表達水平增高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05或p0.01)。而NF-κB的阻滯劑IκB,在hFOB 1.19細胞中下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05或p0.01)。為了進一步證實低氧可以激活NF-κB通路,我們利用NF-κB熒光素酶檢測NF-κB的活性狀態(tài),其中NF-κB熒光素酶含有四個NF-kB結(jié)合位(圖2-9)。與常氧下hFOB 1.19細胞相比,低氧可以激活兩倍量NF-kB熒光素酶(p0.01或p0.001),以上結(jié)果表明,低氧可以誘導p65的表達和激活。3.N-甲基吡咯烷酮影響低氧誘導的成骨細胞分化為研究N-甲基吡咯烷酮影響低氧誘導的成骨細胞分化的可能機制,我們同時檢測了低氧環(huán)境中N-甲基吡咯烷酮處理過的hFOB 1.19細胞中BMP-2, PINP,ALP和RUNX2的含量。我們首先研究了在低氧和常氧環(huán)境下N-甲基吡咯烷酮對hFOB 1.19細胞活力的影響,在常氧環(huán)境下N-甲基吡咯烷酮對hFOB 1.19細胞活力無任何影響,而在低氧環(huán)境下N-甲基吡咯烷酮干擾hFOB 1.19細胞12、24小時后,可以減輕低氧對hFOB 1.19細胞活力的影響(p0.05或p0.01),組間差異具有統(tǒng)計學意義。N-甲基吡咯烷酮減輕低氧對hFOB 1.19細胞活力的影響成劑量依賴性。(p0.05)接著我們用酶聯(lián)免疫吸附試驗研究了缺氧環(huán)境中N-甲基吡咯烷酮處理的hFOB 1.19細胞中BMP-2、PINP、ALP和RUNX-2蛋白表達水平。10 mM N-甲基吡咯烷酮處理hFOB 1.19細胞12或24小時后抑制了hFOB 1.19細胞中BMP-2的含量降低。同樣10mM NMP處理hFOB 1.19細胞12或24小時后抑制了hFOB 1.19細胞中PINP的含量降低,經(jīng)比較,組間差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。同樣N-甲基吡咯烷酮處理hFOB 1.19細胞6或24小時后也抑制了細胞中ALP和RUNX-2的含量降低(p0.05或p0.01)。綜上所述,N-甲基吡咯烷酮抑制低氧誘導的成骨細胞分化減少和成骨細胞的活性下降。4.低氧下,N-甲基吡咯烷酮通過抑制NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)hFOB 1.19細胞的分化。為了研究N-甲基吡咯烷酮對于影響低氧導致的成骨細胞分化降低的機制,我們重新檢測在10 mMN-甲基吡咯烷酮干擾或未加10 mMN-甲基吡咯烷酮干擾情況下,低氧誘導的hFOB 1.19細胞中NF-κB信號通路激活狀態(tài)。10 mMN-甲基吡咯烷酮干擾后,hFOB 1.19細胞中p65 mRNA的水平在低氧環(huán)境下顯著地下降,其蛋白表達也是顯著地下降,而hFOB 1.19細胞中IκB水平卻顯著地提高,(p0.01或p0.001),差異具有統(tǒng)計學意義。NF-κB熒光素酶實驗證實,在低氧環(huán)境下,10 Mm NMP可抑制hFOB 1.19 cells中熒光素酶的活性(p0.05或p0.01)。N-甲基吡咯烷酮抑制在hFOB 1.19細胞中低氧誘導的NF-κB信號通路。結(jié)論1.在低氧環(huán)境中骨折斷端血腫標本、巨噬細胞U937中高遷移率族蛋白B1含量上調(diào)2.高遷移率族蛋白B1促進成骨細胞MG-63增殖并且上調(diào)TLR-43.高遷移率族蛋白B1誘導MG-63細胞中ERK和JNK的磷酸化4.MG-63細胞TLR-4低表達后可以抑制高遷移率族蛋白B1促進MG-63細胞增殖的作用5.TLR-4低表達降低了MG-63細胞中高遷移率族蛋白B1-誘導的ERK和JNK磷酸化6.低氧誘導成骨細胞分化標志骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨膠原前肽Ⅰ,堿性磷酸酶和RUNX2蛋白下調(diào)7.低氧通過NF-κB信號通路誘導成骨細胞去分化激活8.N-甲基吡咯烷酮影響低氧誘導的成骨細胞分化9.低氧下,N-甲基吡咯烷酮通過抑制NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)hFOB 1.19細胞的分化
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R683

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳軍;王良興;;低氧誘導的蛋白表達研究進展[J];醫(yī)學綜述;2006年15期

2 馬子敏,楊曦明,洪欣,孫興斌,謝印芝;低氧誘導法培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2000年05期

3 陳偉,陳家佩;低氧誘導促紅細胞生成素基因表達的機制[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);2000年06期

4 吳鋼,郝亞榮,李庚山,黃從新,王晶,謝強,黃崢嶸;低氧誘導心肌細胞表達血管內(nèi)皮生長因子發(fā)生機制的實驗研究[J];微循環(huán)學雜志;2004年01期

5 王慶華，韓沾元，陳銘，，聞萍;急性低氧誘導大鼠皮層和海馬區(qū)自由基增殖[J];生理學報;1995年05期

6 殷愛紅;武文琦;何麗明;鄭少鵬;;低氧誘導人VEGF基因表達載體的構(gòu)建及其蛋白表達檢測[J];山東醫(yī)藥;2011年52期

7 敖啟林;朱朋成;葛小娜;盧瑋;何惠華;;低氧誘導肺動脈內(nèi)皮細胞間質(zhì)細胞衍生因子-1的表達及其調(diào)控機制[J];中華病理學雜志;2006年09期

8 彭敏戀;戴愛國;蔣永亮;譚永麗;;低氧誘導豬肺動脈內(nèi)皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的鑒定及其生物學意義[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2013年04期

9 吳煥明,尹為華;丹參酮Ⅱ-A硫酸鈉對低氧誘導肺血管平滑肌細胞增殖的影響[J];同濟醫(yī)科大學學報;2001年02期

10 胡娟;鄧貴福;胡媛Y

本文編號：2353240