發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 22:10

【摘要】：研究目的:Apelin能夠調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝,其機(jī)制尚不清楚,而AMPK是否參與該調(diào)節(jié)作用仍存爭議。有氧運(yùn)動(dòng)能夠改善機(jī)體代謝,在有氧運(yùn)動(dòng)中,AMPK在apelin調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝中的作用,有待探究。本研究試圖通過離體和在體實(shí)驗(yàn),探討AMPK在apelin調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝中的作用,以及有氧運(yùn)動(dòng)對其影響。研究方法:(1)采用apelin敲除(KO)和野生鼠(WT)為研究對象,采用美國Columbus公司小鼠氣體代謝監(jiān)測系統(tǒng)測定小鼠運(yùn)動(dòng)能力及24小時(shí)靜息代謝;Western Blot法測定骨骼肌apelin、APJ、p-AMPKα(Thr172)和AMPKα的蛋白表達(dá);Realtime-PCR法測定骨骼肌apelin、APJ、AMPK、NRF1、Tfam、COX4、UCP3、EERα和PPARαmRNA表達(dá),以期觀察apelin缺失對小鼠運(yùn)動(dòng)能力、全身和骨骼肌能量代謝的影響。(2)采用C2C12細(xì)胞為研究對象,通過小干擾RNA(siRNA)沉默細(xì)胞中AMPKα的表達(dá),然后加入apelin-13孵育。采用美國Seahorse細(xì)胞能量代謝分析系統(tǒng)測定C2C12細(xì)胞線粒體能量代謝;酶活性檢測試劑盒測定細(xì)胞檸檬酸合酶(CS)活性,以期探討AMPK在apelin調(diào)節(jié)C2C12細(xì)胞線粒體能量代謝中的作用。(3)采用AMPKα2敲除鼠(KO)和野生鼠(WT)為研究對象,腹腔注射apelin-13,并進(jìn)行4周有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,運(yùn)動(dòng)組采用75%左右最大攝氧量運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動(dòng),每天1小時(shí),每周6天,共4周。采用Western Blot法測定骨骼肌apelin、APJ、p-AMPKα(Thr172)、AMPKα、PGC-1α、UCP3、COX4、線粒體呼吸鏈復(fù)合物(Complex)Ⅰ-Ⅴ蛋白的表達(dá),以期揭示AMPK在apelin調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝中的作用及有氧運(yùn)動(dòng)對其的影響。研究結(jié)果:(1)apelin KO鼠與WT鼠相比,運(yùn)動(dòng)能力指標(biāo)中的最大跑速、最大跑距、最大攝氧量和力竭時(shí)間均顯著降低(p0.01);apelin KO鼠與WT鼠相比,24小時(shí)靜息代謝指標(biāo)中的能量消耗、呼吸熵、氧氣消耗量和二氧化碳產(chǎn)生量均顯著降低(p0.01);apelin KO鼠與WT鼠相比,骨骼肌apelin、APJ mRNA(p0.01)、蛋白(p0.05)表達(dá)均顯著降低;apelin KO鼠與WT鼠相比,骨骼肌p-AMPK/AMPK顯著降低(p0.01)。(2)si-Control+apelin-13組與si-Control+PBS組相比,細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸率、ATP生成、最大呼吸率、空余呼吸率和CS活性均顯著增加(p0.01);si-AMPK+apelin-13組與si-Control+apelin-13組相比,基礎(chǔ)呼吸率、ATP生成、最大呼吸率、空余呼吸率和CS活性均顯著降低(p0.05)。(3)在安靜狀態(tài)下,WT+apelin-13組與WT組相比,小鼠骨骼肌apelin、APJ、p-AMPK、COX4和UCP3蛋白表達(dá)和p-AMPKα/AMPKα比值均顯著增加(p0.01),AMPKα2 KO+apelin-13組與WT+apelin-13組相比,小鼠骨骼肌apelin、APJ、COX4和UCP3蛋白表達(dá)均顯著降低(p0.01);在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,WT+apelin-13組與WT組相比,小鼠骨骼肌apelin、APJ、COX4、UCP3蛋白表達(dá)和p-AMPKα/AMPKα比值均顯著增加(p0.05);AMPKα2 KO+apelin-13組與WT+apelin-13組相比,小鼠骨骼肌apelin、APJ蛋白表達(dá)顯著降低(p0.05)。結(jié)論:Apelin在小鼠能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,且補(bǔ)充apelin-13可以通過AMPK促進(jìn)骨骼肌能量代謝;但4周75%左右最大攝氧量強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練未對apelin/AMPK/骨骼肌能量代謝這一途徑產(chǎn)生影響。
【圖文】：

1993 發(fā)現(xiàn)了一種新的 G 蛋白耦聯(lián)受體，它與血管緊張素Ⅱ受體-giotensin II type 1 receptor，AT1R）同源，被命名為 APJ[1]。1998 年提取出 的內(nèi)源性配體，命名為愛帕琳肽（apelin）[2]。人 apelin 基因定位于染色體 Xq25-26.1，大鼠和小鼠的基因位于染色體.2 上[3]。人體 apelin 基因由 3 個(gè)外顯子和 2 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其前體肽含有 7基酸，C 端主要參與生物活性的調(diào)控，N 端是和 APJ 結(jié)合的部位[4]。Apeli多肽片段，如 Apelin- 36、31、19、17、16、13[5]。Apelin-13 是所 apelin 結(jié)基礎(chǔ)，同時(shí)也是生物活性最強(qiáng)的 apelin 形式之一。自從被發(fā)現(xiàn)開始，一致認(rèn)管緊張素轉(zhuǎn)化酶是剪切 apelin 產(chǎn)生不同亞基的唯一酶。但是最近的一項(xiàng)研究前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶可能會(huì)裂解 apelin 蛋白前體，并直接進(jìn)入in-13 而不產(chǎn)生其他 apelin 形式[6]。另金屬蛋白酶腦啡肽酶（Neprilysin，NEP通過蛋白水解酶的方式降解和滅活 apelin 肽，是新發(fā)現(xiàn)的 apelin 剪切酶[7]。

圖 2 AMPK 的基本結(jié)構(gòu)（引用自 Rasmus Kj bsted, et al.，2018）α亞基含有激酶結(jié)構(gòu)域（KD），，其活性依賴于上游 AMPK 激酶對 Thr172磷酸化。KD 之后是自抑制結(jié)構(gòu)域（AID）和α-鉤（αH）。在α-C 端檢測到與β端相互作用位點(diǎn)（β-ID）[63]。α亞基含有激酶結(jié)構(gòu)域，活性高度依賴于α-Thr1的可逆磷酸化[64]。β亞基充當(dāng)結(jié)合α和γ亞單位的支架，α-和γ-相互作用結(jié)構(gòu)（α-ID，γ-ID）位于β-C 末端。β亞基中的 GBD 是 AMPK 與受到糖調(diào)控的位Ser108 和 Thr148 這 2 個(gè)磷酸化位點(diǎn)存在于 GBD 中[65]。β亞基 N 末端可以進(jìn)行蔻�；土姿峄姆g后修飾，這與 AMPK 易位至特定的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室功能相[63]。γ-亞基含有 4 個(gè)胱硫醚-β-合酶（CBS）結(jié)構(gòu)域。它們以串聯(lián)對的形式存在也稱為 Bateman 結(jié)構(gòu)域，并且參與腺苷核苷酸結(jié)合。當(dāng) AMP 結(jié)合到兩個(gè) Batem區(qū)域時(shí)，γ-亞基發(fā)生構(gòu)象變化，使α亞基的磷酸化位點(diǎn)暴露[63]。因此，γ亞基通腺苷核苷酸的直接結(jié)合作為細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的傳感器起作用[66]，此外γ亞基同型的 N-末端延伸不同，AMPK 的定位也不同[67]。
【學(xué)位授予單位】：北京體育大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：G804.7

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本文編號：2594009