【摘要】：目的:1.目前,腦皮質撞擊法是一種較為常用的顱腦創(chuàng)傷(TBI)模型構建方法,但具體的打擊參數尚無統(tǒng)一標準。本部分實驗通過設置腦皮質撞擊儀不同參數,造成TBI大鼠模型不同程度的損傷,為構建TBI模型時參數的設定提供更多參考。2.國內在顱腦創(chuàng)傷的基礎及臨床研究中不斷深化,治療效果顯著提高,但仍有諸多問題亟待解決,特別是TBI后腦水腫、線粒體的功能障礙,遲發(fā)性神經元損傷等繼發(fā)性損傷的防治。然而病理過程的復雜也導致了缺乏有針對性的治療藥物。盡管制藥公司投資了數十億美元用于TBI相關藥物研發(fā),但至今仍沒有明確有效的藥物可用于TBI急性期的治療。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一種普遍存在的嘧啶核苷酸,在諸多細胞生理進程中發(fā)揮重要作用,包括細胞新陳代謝,ATP的生成,和DNA的修復。目標體溫管理(TTM)治療的方法一直延續(xù)至今,合理應用下可見其治療效果十分可觀。為此,本部分實驗擬基于線粒體生物合成機制,探索NAD聯(lián)合TTM對重度TBI神經功能的影響。3.顱腦創(chuàng)傷后往往由于開顱減壓等原因會導致顱骨缺損,這既會影響美觀,并造成患者心理上的焦慮與恐懼,同時也容易誘發(fā)癲癇發(fā)作。骨的同種異體移植物和自體移植物是當前治療骨缺損的標準,然而在臨床應用中會受到諸多客觀條件限制。目前隨著骨組織工程技術的發(fā)展,利用3D支架和自體干細胞聯(lián)合完成顱骨缺損的修復已成為研究熱點。本部分將利用骨組織工程技術構建絲素蛋白/殼聚糖/透明質酸復合支架,并將骨髓間充質干細胞與其共培養(yǎng),通過觀察該細胞在支架上的增殖與分化,從而評估該復合支架應用于顱骨缺損修復的可能性。方法:1.56只大鼠按隨機數字法隨機等分為7組,即V1、V2、V3、D1、D2、D3和對照組,利用電子腦皮質打擊儀構建不同損傷程度TBI模型,其中V組的打擊最低點持續(xù)時間均為200毫秒,打擊深度均為2mm,V1、V2和V3組的打擊速率分別為3 m/s、4 m/s和5 m/s;D組的打擊最低點持續(xù)時間均為200毫秒,打擊速率均為5 m/s,D1、D2和D3組的打擊深度分別為3mm、4mm、5mm。術后48小時行改良神經功能損傷評分、網屏實驗評分、曠場試驗評分,并測定腦組織含水量。2.將72只大鼠按隨機數字法隨機取12只大鼠作為對照組。剩余60只大鼠行TBI造模,使用3mm打擊帽,使打擊面與腦皮質表面基本平行并精確打擊大鼠大腦皮層。按最低點持續(xù)時間均為200ms,4mm的打擊深度,5m/s的打擊速度構建重度TBI大鼠模型。在完成造模后,將60只TBI大鼠隨機等分為5組,即TBI組(T group)、TBI+TTM組(T+T group)、TBI+NAD組(T+N group)、TBI+TTM+NAD組(T+T+N group)和TBI+TTM+NAD+NAD抑制劑組(T+T+N+I group)。另外12只大鼠不進行任何處理,作為對照組(C group)。將NAD的前體-煙酰胺單核苷酸(NMN)和NAD抑制劑FK866分別溶于生理鹽水中,配制成5%濃度的溶液。TBI+NAD組、TBI+TTM+NAD組和TBI+TTM+NAD+NAD抑制劑組大鼠按照500mg/kg體質量的劑量,于造模后第二天起每日8時和18時腹腔注射NMN,連續(xù)7天,另兩組TBI大鼠于同一時間注射同等劑量的生理鹽水,TBI+TTM+NAD+NAD抑制劑組于腹腔注射NMN后1h后,腹腔注射FK866,40mg/kg。TBI+TTM組、TBI+TTM+NAD組和TBI+TTM+NAD+NAD抑制劑組在TBI后行TTM治療,具體方法如下:將亞低溫治療儀連接后,設定冰毯溫度為7℃,時程設定為6h,在TBI后10分鐘,將大鼠置于冰毯上,約20分鐘后肛溫達到33℃-34℃后,每間隔30分鐘測一次溫度以保持體溫維持在亞低溫水平。治療結束后,將大鼠放入室溫環(huán)境以緩慢復溫。于最后一次腹腔注射操作后的12h,進行行為學評分,包括網屏實驗和改良神經功能損傷評分。待上述實驗完成后,頸椎離斷法處死大鼠,每組隨機選取3只大鼠,取出腦組織并去除延髓及以下部分測腦組織含水量。每組大鼠中另取3只,切取損傷側同一部位組織標本,分別稱取重量50mg,酶聯(lián)免疫吸附法檢測NAD、丙二醛、腫瘤壞死因子-α。另取損傷側同一部位腦組織約5mg并置于1.5ml無菌離心管內,提取組織DNA和總RNA。Real-time PCR法計算線粒體拷貝數,以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)、PGC-1β、過氧化物酶體增生物激活受體δ(PPARδ)、核呼吸因子-1(NRF1)、NRF2、線粒體轉錄因子-A(TFAM)、B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)和bax基因的相對表達量。Western blot法檢測S100β蛋白、水通道蛋白4(AQP4)、緊密橋接蛋白(TJPs)。免疫熒光法檢測膠質細胞內受體相互作用蛋白1(RIP1)的表達情況。3.取5只SD大鼠,取出骨髓,利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離并培養(yǎng)骨髓間充質干細胞。隨后利用家蠶生絲制備絲素蛋白溶液,將殼聚糖和透明質酸分別溶于醋酸溶液中,制成2%殼聚糖溶液,和2%透明質酸溶液,按照絲素蛋白:殼聚糖:透明質酸=2:4:1的比例配置混合液,用磁力攪拌棒充分混勻后,將混合液移入鑄模中,設置3D打印機參數,經冷凍干燥制作出固體模型。采用無水乙醇液體置換法,測量復合支架的孔隙率,應用Instron5865軟件,通過繪制應力與應變相對變化曲線得出彈性模,將三維支架切割成為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的正方體,與生長相對良好的第3代骨髓間充質干細胞細胞懸液共培養(yǎng),并加入成骨誘導分化培養(yǎng)液,成骨誘導約7天后用掃描電子顯微鏡下觀察支架及其中細胞生長情況。另取5塊96孔板,每板使用8孔,其中在4孔內預先放入支架。取生長相對良好的第3代骨髓間充質干細胞,按照3000個/孔的密度,每孔內加入骨髓間充質干細胞細胞懸液150μl/孔,每隔日取出一板細胞,MTT法測細胞生長曲線。取誘導培養(yǎng)14 d后的兩組細胞,茜素紅染色法檢測礦物結節(jié),real-time PCR法檢測骨橋蛋白、骨鈣素和I型膠原等成骨相關基因表達水平的變化。結果:1.隨著打擊速率及打擊深度的增加,神經功能損傷評分整體呈上升趨勢,與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.05);網屏實驗評分方面,除V1組外,其余各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);D3組的網屏實驗評分雖略高于D2組,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);D1與D2組比較,差異亦無統(tǒng)計學意義(P0.05);曠場試驗評分中,水平得分方面,與對照組比較,V3組以及D1至D3組得分降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而D1、D2、D3三組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。垂直得分中,與對照組比較,模型組得分降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),雖然隨著損傷程度的逐漸加重,得分整體呈降低趨勢,但V1與V2比較,以及V2至D2組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。大便粒數方面,各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);腦含水量方面,各TBI組大鼠腦含水量隨著損傷嚴重程度的增加,整體呈增高趨勢,V2至D3組與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),但V3組與D1組比較差異無統(tǒng)計學意義,D1組與D2組比較,差異亦無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.與對照組比較,TBI后各組大鼠的神經功能損傷評分均顯著升高,而應用NAD及TTM后神經功能損傷評分顯著降低,兩者連用降低程度更為明顯(P0.05);與對照組比較,TBI后各組大鼠的網屏實驗評分均顯著升高,而單獨應用NAD或TTM,以及NAD與抑制劑合用后評分雖有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),NAD與TTM合用可顯著降低(P0.05);與對照組比較,TBI后各組大鼠的腦含水量均顯著升高;而與TBI組比較,應用NAD或TTM后,腦含水量顯著降低,NAD與TTM合用后,腦含水量進一步降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),腹腔注射NMN后,TBI+NAD組和TBI+TTM+NAD組大鼠腦組織中NAD含量均顯著高于未注射NMN組的大鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);免疫熒光結果顯示,大鼠損傷側腦組織可見細胞質內RIP1均有表達,正常組大鼠腦組織幾乎不可見RIP1陽性細胞。而與TBI組相比,應用TTM后組腦組織中RIP1陽性細胞數均能夠顯著降低,NAD與TTM合用組陽性細胞數降低更加明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。但單獨應用NAD組與TBI組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);與對照組比較,TBI后各組大鼠的腦組織中丙二醛、腫瘤壞死因子-α、S100β、AQP4和TJPs蛋白表達顯著升高;而與TBI組比較,應用NAD或TTM后,S100β、AQP4蛋白表達顯著降低,NAD與TTM合用后,丙二醛、腫瘤壞死因子-α、S100β、AQP4和TJPs蛋白表達進一步降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與對照組比較,TBI后各組大鼠的腦組織中線粒體拷貝數增加,PGC-1α、PGC-1β、PPARδ、NRF1、NRF2、TFAM和bax基因轉錄水平升高,bcl-2轉錄水平減低;而與TBI組比較,應用NAD后,線粒體拷貝數進一步增加,PGC-1α、PGC-1β、PPARδ、NRF1、NRF2、TFAM基因轉錄水平升高;NAD與TTM合用后,與單獨應用TTM或NAD組及加用NAD抑制劑組相比,線粒體拷貝數進一步增加,PGC-1α、PPARδ、NRF2、TFAM和bcl-2基因轉錄水平升高,bax轉錄水平減低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),單獨應用TTM組以及NAD抑制劑組與TBI組相比,bcl-2基因轉錄水平升高bax轉錄水平減低(P0.05),但線粒體生物合成相關基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.提取分離到的骨髓間充質干細胞濃度較大,在顯微鏡下,可見細胞呈圓形,胞漿較豐滿,呈細沙狀懸浮在培養(yǎng)基中。骨髓間充質干細胞在培養(yǎng)過程中,大約24小時即可呈現貼壁生長狀態(tài),生長較為緩慢。換液后細胞的增殖情況明顯增強,出現梭形為主的多種細胞形態(tài)。12天時細胞形態(tài)較單一,多呈梭形、漩渦狀和放射狀排列。絲素蛋白/殼聚糖/透明質酸復合支架可見支架表面較光滑,表面可見平均直徑為200-250μm的孔隙,分布均勻,且相互連通,孔壁厚度約6μm。5塊絲素蛋白/殼聚糖/透明質酸復合支架的孔隙率測量結果為30.13±4.40%。該復合支架質地較為堅韌,浸泡PBS后略變軟,形態(tài)具有延展性和可復性。復合支架壓縮模量為(12.53±1.69)k Pa。掃描電子顯微觀察顯示,復合支架呈多層立體結構,支架表面及支架內部可見附著較多骨髓間充質干細胞,呈串珠狀,MTT法檢測骨髓間充質干細胞的增值情況,可見培養(yǎng)初期細胞生長速度較為緩慢,在前3天屬于生長滯緩期。從第6天起,細胞的增殖速度明顯增快,提示細胞此時已經適應培養(yǎng)基的環(huán)境,屬于指數生長期。吸光度值在細胞培養(yǎng)第8天時達到高峰,隨即變平穩(wěn),屬于細胞生長平臺期,此生長曲線也較好的反映了骨髓間充質干細胞生長的周期特點,且兩組細胞的增殖趨勢一致,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。兩組骨髓間充質干細胞經過成骨誘導培養(yǎng)2周后,用茜素紅進行染色,微鏡下可見橘紅色沉淀,即茜素紅染色陽性,表明骨髓間充質干細胞成功向成骨細胞表型進行了分化。在接種兩周后,可見與復合支架共培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞的骨鈣素、骨橋蛋白、及I型膠原基因轉錄水平均顯著高于正常培養(yǎng)的細胞,兩組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.在固定打擊最低點持續(xù)時間均為200毫秒的情況下,以2mm的打擊深度,4 m/s的打擊速度構建輕度TBI大鼠模型,以2mm的打擊深度,5 m/s的打擊速度構建中度TBI大鼠模型,以4mm的打擊深度,5m/s的打擊速度構建重度TBI大鼠模型,具有較好的成功率和區(qū)分度,該參數更為適合構建不同損傷程度的TBI大鼠模型。2.在重度TBI后,應用NAD可顯著促進線粒體的生物合成,從而提高腦組織的能量供應,改善神經功能。TTM的應用可有效抑制細胞的凋亡,并給予受損腦組織更長的修復時間窗。兩者合用可發(fā)揮相互協(xié)同作用,進一步降低炎癥及氧化應激水平,降低血腦屏障通透性,減輕腦水腫,從而發(fā)揮神經保護作用,這也為日后的臨床治療TBI提供了新策略。3.本實驗通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離并培養(yǎng)出了骨髓間充質干細胞,實驗結果提示細胞純度較高、細胞活性較強,作為骨組織工程中的種子細胞較為適宜。通過3D打印技術構建的絲素蛋白/殼聚糖/透明質酸復合支架,具有良好的生物相容性、機械性能以及多孔性,復合骨組織工程對支架理化性質的要求,同時該支架還可上調成骨相關基因的轉錄,促進骨髓間充質干細胞的成骨分化,這也為骨組織工程修復骨缺損提供了潛在的治療選擇,應用前景良好。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15
【圖文】：

（C group）。手術開始前，每只大鼠均組腹腔注射青霉素 10 萬單位，隨 5%水合氯醛，按每千克給予 7ml 的劑量將模型組大鼠麻醉。大鼠顱頂剃后剪開皮膚，暴露右側頂骨，以前囟向后 3 毫米，矢狀縫右側旁開 2.5 毫心，取一直徑約 5 毫米圓形，用手術刀片清理暴露區(qū)域內顱骨表面的軟開骨窗之后固定大鼠于打擊平臺之上。將腦皮質撞擊儀的打擊臂角度調垂直方向呈 20°，使打擊平面與腦皮質的表面保持平行，選用 3mm 打擊打擊大鼠的大腦皮層。打擊參數如下：V 組的打擊最低點持續(xù)時間均為 ，打擊深度均為 2mm，V1、V2 和 V3 組的打擊速率分別為 3 m／s 、4 和 5 m／s；D 組的打擊最低點持續(xù)時間均為 200 毫秒，打擊速率(veloc 5 m／s ，D1、D2 和 D3 組打擊深度分別為 3mm、4mm、5mm。打擊后膚。見圖 1。對照組正常飼養(yǎng)不進行額外操作。若出現術后死亡大鼠則進的增補。評分人員首先經過相關培訓，于造模后 48h，在不知分組情況的，對大鼠神經功能進行相應的評分。

醫(yī)科大學博士學位論文 一、腦皮質撞擊法構建顱腦創(chuàng)傷大鼠模型中果各組存活情況D2 組在術后 48h 內死亡 2 只，D3 組在術后 48h 死亡 4 只。神經功能損傷評分隨著打擊速率以及打擊深度的增加，神經功能損傷評分整體照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P<0.05），見圖 2。

圖 3 各組大鼠的網屏實驗得分比較 *：與對照組 曠場試驗結果各 TBI 模型組中，水平得分方面，V3 組以及 D1 至 D，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），D1 至 D3 三組之間比P>0.05）。垂直得分方面，對照組比較模型組均降低，差<0.05），雖然隨著損傷程度的逐漸加重，得分整體呈降低，以及 V2 至 D2 組之間的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.0間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖 4。

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