本文關鍵詞：斑馬魚活性Tc1轉座子的挖掘及驗證

  更多相關文章： 轉座子 轉基因 轉座活性 斑馬魚 小鼠 基因治療

【摘要】：轉座子廣泛分布于細菌、真菌及昆蟲等各種生物中,是一種可以在基因組內移動的DNA元件,在轉基因和基因治療等領域具有很好的應用前景。目前國際上轉座子的研發(fā)和應用研究取得顯著進展,女PB、SB、Tol2等轉座子已經作為基因治療和轉基因的介導載體得到廣泛應用,但國內自主知識產權的轉座子研發(fā)相對滯后。本研究通過斑馬魚基因組上DNA轉座子挖掘,并經過脊椎動物細胞和胚胎水平驗證,獲得高活性ZB轉座子,為動物轉基因、功能基因組學(基因捕獲等)和基因治療等研究提供具有自主知識產權的遺傳操作工具。主要研究內容如下：(1)通過生物信息學分析,在斑馬魚基因組中發(fā)現(xiàn)5個結構完整的Tc1/Mariner家族DNA轉座子。遺傳分化比較表明,其中1個轉座子活性最強,是年輕轉座子,命名為ZB。完整ZB轉座子全長1.4kb,兩端各有一個對稱的203bp的末端反向重復序列,中間含有1026bp的轉座酶基因編碼序列。斑馬魚基因組中至少存在21個ZB拷貝,其中16個為完整的拷貝,DNA序列和ORF的氨基酸序列的同源性分別為99.80%和99.47%。ZB兩端的TIR序列相似性達100%。其ORF含有Tcl轉座子典型的保守結構域(如HTH、NLS、DD34E等)。(2)經過qPCR和原位雜交檢測表明,ZB轉座酶的正反轉錄子在斑馬魚在所檢測的11階段都有表達,且表達強度隨著時間的增加而升高。在成年斑馬魚大腦、心臟、肌肉、睪丸和卵巢組織中表達存在差異,且在大腦中表達量最高,在心臟、睪丸和卵巢組織較低。(3)為驗證ZB在哺乳動物細胞上的活性,克隆ZB轉座子的上下游TIR轉座元件和轉座酶ORF,分別構建成框架載體pZB-Msc和轉座酶輔助質粒(pCMV-ZB)。再將含有新霉素性基因表達盒(PGK-NEO)克隆至轉座子框架載體pZB-Msc,形成轉座子供體質粒pZB-PGK-NEO,然后將轉座子(pZB-PGK-NEO)和轉座酶以不同質量比共轉染Hela細胞,并與PB、SB和To12轉座子進行比較。試驗結果表明4種轉座子實驗組表達新霉素抗性基因的細胞數(shù)量均高于對照組,且ZB轉座子體統(tǒng)在1：1質量比時含抗性的細胞數(shù)量最多,即轉座效率最高。ZB在10：1,2：1,1：1,1：2質量比時,抗性細胞數(shù)量高于SB轉座子,且在1：1時差異明顯(P0.01)。ZB的轉座效率可以與PB媲美,高于SB和TOL2(P0.05)。(4)為驗證ZB在斑馬魚胚胎上的轉座活性,將含有鯉魚beta-actin啟動子和GFP基因的綠色熒光蛋白表達盒(FAG-GFP)分別克隆至轉座子框架載體pZB-Msc,形成轉座子供體質粒,然后將轉座子(含F(xiàn)AG-GFP表達盒)和轉座酶mRNA共注射斑馬魚一細胞期胚胎,注射后觀察熒光,比較4種轉座子的轉座效率,試驗結果表明,在注射后24hpf和5dpf的GFP陽性率ZB轉座子均高于其它3種轉座子,且顯著高于SB轉座子(P0.05)。(5)為驗證ZB在小鼠胚胎上的轉座活性,將含有雞beta-actin啟動子和GFP基因的綠色熒光蛋白表達盒(CAG-GFP)克隆至轉座子框架載體pZB-Msc,形成轉座子供體質粒,然后將轉座子(含CAG-GFP表達盒)和轉座酶共注射小鼠受精卵,注射后胚胎發(fā)育至囊胚期觀察熒光,每組重復三次,試驗結果顯示3組胚胎均有熒光,加轉座酶質粒組、轉座酶mRNA組和未加轉座酶組的胚胎陽性率分別為31.76%(n=110)、33.43%(n=147)和4.34%(n=162),加轉座酶組的胚胎陽性率均顯著高于未加轉座酶組(P0.05),加轉座酶組的胚胎陽性率之間差異不顯著(P0.05)。本研究表明,新發(fā)現(xiàn)的ZB轉座子是高活性轉座子,該轉座子能夠在哺乳動物細胞、小鼠胚胎和斑馬魚胚胎上高效介導外源基因轉移,在轉基因動物制備和基因治療中具有較好的應用前景。
【關鍵詞】：轉座子 轉基因 轉座活性 斑馬魚 小鼠 基因治療
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 英文縮略詞11-12
• 前言12-13
• 第一篇 文獻綜述 Tc1/Mariner超家族的研究進展13-26
• 1 Tc1/Mariner轉座子結構14-15
• 2 Tc1/Mariner的轉座機制15-16
• 3 Tc1/Mariner轉座子超家族的分類及分布16-18
• 4 活性Tc1/Mariner轉座子的挖掘及活性驗證18-20
• 5 Tc1/Mariner轉座子應用研究現(xiàn)狀20-26
• 5.1 轉基因21-22
• 5.2 基因捕獲22-25
• 5.3 基因治療25-26
• 第二篇 試驗研究26-64
• 第一章 斑馬魚Tc1轉座子家族生物信息學分析26-35
• 1 材料與方法26-27
• 1.1 Tc1轉座子的挖掘26-27
• 1.2 進化樹構建27
• 1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析27
• 2 結果27-34
• 2.1 斑馬魚Tc1成員及構成27-29
• 2.2 斑馬魚Tc1轉座子活性比較29-30
• 2.3 斑馬魚Tc1-c轉座子活性預測30-34
• 3 討論34-35
• 第二章 斑馬魚ZB轉座子的時空表達特性35-45
• 1 材料與方法35-40
• 1.1 實驗材料35-36
• 1.2 實驗方法36-40
• 2 結果40-44
• 2.1 斑馬魚ZB轉座酶mRNA的時空表達譜40-41
• 2.2 斑馬魚早期胚胎中表達ZB轉座酶RNA原位雜交結果41-44
• 3 討論44-45
• 第三章 細胞水平活性驗證45-55
• 1 材料與方法45-49
• 1.1 菌株及試劑45
• 1.2 載體構建所用引物的設計與合成45-46
• 1.3 轉座子供體pZB-Msc的構建46-47
• 1.4 轉座酶表達載體pCMV-ZB的構建47-48
• 1.5 pZB-PGK-NEO載體構建48
• 1.6 細胞水平驗證(Hela)ZB轉座活性48-49
• 2 結果49-54
• 2.1 ZB轉座元件的克隆與鑒定49-50
• 2.2 pZB-Msc載體的構建與鑒定50
• 2.3 ZB轉座酶輔助質粒的構建與鑒定50-51
• 2.4 PGK-NEO-bGHpA的克隆及鑒定51-52
• 2.5 細胞水平驗證ZB轉座活性52-54
• 3 討論54-55
• 第四章 胚胎水平活性驗證55-64
• 1 材料與方法55-58
• 1.1 菌株及試劑55
• 1.2 轉座酶體外轉錄輔助質粒pTNT-ZB的構建55-56
• 1.3 轉座子載體pZB-CAG-GFP的構建56
• 1.4 轉座子載體pZB-FAG-GFP的構建56-57
• 1.5 體外轉錄制備轉座酶mRNA57
• 1.6 斑馬魚胚胎水平驗證ZB轉座活性57-58
• 1.7 小鼠胚胎水平驗證ZB轉座活性58
• 2 結果58-62
• 2.1 pTNT-ZB載體的構建與鑒定58-59
• 2.2 pZB-CAG-GFP載體的構建與鑒定59
• 2.3 pZB-FAG-GFP載體的構建與鑒定59-60
• 2.4 ZB-mRNA制備與鑒定60
• 2.5 斑馬魚胚胎水平驗證ZB轉座活性60-62
• 2.6 小鼠胚胎水平驗證ZB轉座活性62
• 3 討論62-64
• 全文結論64-65
• 參考文獻(References)65-73
• 致謝73-74
• 攻讀學位期間發(fā)表學術論文74-75

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸德如;細菌轉座子及其在分子遺傳學中的應用[J];微生物學免疫學譯刊;1984年01期

2 全登莊;可移動的遺傳因子轉座子及其效應[J];西北師范大學學報(自然科學版);1985年04期

3 傅榮昭，，李文彬，孫勇如;植物轉座子在基因工程應用上的研究進展[J];生物工程進展;1994年05期

4 李鳳玲,趙毓橘;植物轉座子[J];植物生理學通訊;2000年05期

5 何承忠,陳寶昆,江濤,張志毅,李善文;植物轉座子的研究與應用[J];西南農業(yè)學報;2004年03期

6 王瑞白,闞飆;轉座子插入位點的鑒定方法[J];生物技術通訊;2005年03期

7 高東迎;何冰;孫立華;;水稻轉座子研究進展[J];植物學通報;2007年05期

8 韓民錦;李雪;張澤;;轉座子顯示技術及其在家蠶遺傳進化研究中的應用展望[J];蠶學通訊;2008年04期

9 張博;陳兵;張青文;康樂;;昆蟲的轉座子及其功能[J];昆蟲知識;2009年02期

10 田海霞;;轉座子在基因組和基因進化方面的研究進展[J];安徽農業(yè)科學;2011年20期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高才華;肖美麗;任小東;Alice Hayward;殷家明;付東輝;李加納;;真核生物基因組中嵌合轉座子的特征分析和功能注釋[A];中國遺傳學會第九次全國會員代表大會暨學術研討會論文摘要匯編（2009-2013）[C];2013年

2 嚴冰;曾慶韜;錢遠槐;;黑腹果蠅黑條體突變體中轉座子分布的多樣性研究[A];中國動物科學研究——中國動物學會第十四屆會員代表大會及中國動物學會65周年年會論文集[C];1999年

3 張云峰;;小麥中轉座子存在的可能性初探[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

4 曲志才;姜曰水;;山東部分地區(qū)灰飛虱mariner類轉座子研究[A];中國遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

5 周祥;白林泉;鄧子新;;井岡霉素產生菌的全基因組轉座子突變[A];2008年中國微生物學會學術年會論文摘要集[C];2008年

6 逄曉陽;李晶;劉國文;王哲;;利用轉座子誘變構建反芻月形單胞菌乙酸生成關鍵酶基因缺失工程菌[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2006學術年會論文集（上冊）[C];2006年

7 瞿婷婷;俞云松;魏澤慶;陳亞崗;李蘭娟;;萬古霉素耐藥腸球菌耐藥轉座子結構及MLST分型[A];2007年浙江省醫(yī)學病毒學、醫(yī)學微生物與免疫學學術年會論文匯編[C];2007年

8 何澤;曹廣力;薛仁宇;陳淼;陳文柱;王崇龍;鄭小堅;沈衛(wèi)德;貢成良;;用piggyBAC轉座子進行家蠶轉hGM-CSF基因研究[A];中國蠶學會第四屆青年學術研討會會議論文集[C];2004年

9 鐘仰進;楊婉瑩;曹陽;黃亞東;溫碩洋;勞海華;陳維春;;家蠶K1.4轉座子的拷貝多態(tài)性及K1.4主拷貝的序列特征研究[A];中國的遺傳學研究——中國遺傳學會第七次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編[C];2003年

10 程洛單;鄒曙明;田玉梅;杜雪地;;金魚hAT家族Tgf2轉座子在斑馬魚胚胎中的自我剪切[A];2012年中國水產學會學術年會論文摘要集[C];2012年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 馮衛(wèi)東;轉座子榮居自然界最豐富基因榜首位[N];科技日報;2010年

2 本報記者 馮衛(wèi)東;遺傳基因中的“侵略者”[N];科技日報;2008年

3 樸淑瑜;科學家找到大麥白粉病“元兇”[N];科技日報;2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 葉露鵬;高效家蠶絲腺生物反應器的關鍵因素分析[D];浙江大學;2015年

2 宋成義;不同DNA轉座子在哺乳動物細胞和胚胎中轉座活性研究及新轉座子的挖掘[D];中國農業(yè)科學院;2014年

3 覃成;基于栽培辣椒和野生辣椒的全基因組測序揭示辣椒屬的馴化與特異性[D];四川農業(yè)大學;2014年

4 劉東;多倍體魚轉座子的遺傳變異和雌核發(fā)育魚性腺發(fā)育的分子生物學研究[D];湖南師范大學;2009年

5 張化浩;家蠶基因組中轉座子的水平轉移[D];重慶大學;2014年

6 陳勇;全基因組中網絡缺失基因和微型轉座子的發(fā)現(xiàn)及研究[D];山東大學;2008年

7 馬峇;桑樹全基因組轉座子的鑒定及特征分析[D];西南大學;2014年

8 丁f;piggyBac轉座系統(tǒng)[D];復旦大學;2007年

9 王娜;基于piggyBac轉座子的家蠶定向遺傳轉化研究[D];浙江大學;2010年

10 吳敏;鱗翅目昆蟲中piggyBac轉座子研究[D];南京農業(yè)大學;2008年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 高杰;家蠶內源性piRNA促進家蠶piggyBac轉座子的穩(wěn)定性[D];西南大學;2015年

2 楊晶晶;組織培養(yǎng)誘導下水稻met1-2突變體反轉座子Tos17活性與組蛋白修飾關系研究[D];東北師范大學;2015年

3 潘曉寒;外源序列插入位點在基因組中的分步特征[D];南京大學;2013年

4 倪欣濤;鴨疫里默氏桿菌轉座子隨機突變庫的構建及毒力相關基因的篩選和鑒定[D];安徽農業(yè)大學;2014年

5 李曉歡;二化螟Ty3/gypsy反轉座子的克隆與序列分析[D];南京農業(yè)大學;2014年

6 熊杵林;昆蟲MITE轉座子的比較基因組分析及數(shù)據(jù)庫的構建[D];重慶大學;2015年

7 魏彬;基因組重測序作物的新轉座子鑒定及特征分析[D];四川農業(yè)大學;2014年

8 陳楚潤;基于基因組重測序的玉米溫熱帶自交系轉座子特征分析[D];四川農業(yè)大學;2015年

9 王菁菁;煙草基因組一類微小倒置重復轉座元件（MITE）的轉座活性及真應用[D];浙江大學;2016年

10 韓雪;化膿隱秘桿菌轉座子分布與耐藥相關性及木犀草素對轉座子tnpA影響的研究[D];沈陽農業(yè)大學;2016年

本文編號：775901