本文關鍵詞：農桿菌介導抗菌肽Rev4基因的紫花苜蓿遺傳轉化體系的建立

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【摘要】：紫花苜蓿(Medicago.Sativa.L)以“牧草之王”著稱,是世界上分布最廣的優(yōu)良牧草。長期以來,人們圍繞經濟有效地提高紫花苜蓿產量和質量兩大目標進行了不懈的努力。傳統(tǒng)育種方法時間長、成本高且可利用的種質資源有限。植物基因工程更具有科學性和準確性。農桿菌介導的遺傳轉化法是目前研究最多、使用頻率最高的方法之一。Indolicidin是一個13殘基酰胺肽(IL-PWKWPWWPWRR-NH2),最初分離自牛嗜中性粒細胞的胞漿小顆粒,具有廣譜抗細菌活性和抗病毒活性�？咕腞ev4是根據Indolicidin設計的反向類似物。本實驗以紫花苜蓿種子為外植體,利用根癌農桿菌A.GV3850介導的種子整體侵染法進行遺傳轉化。首先將侵染后的紫花苜蓿種子經卡那霉素75mg/L(Kan75)壓力篩選45 d左右,獲得68株具有卡那抗性的苜蓿植株。提取抗性植株的基因組,并對其進行PCR擴增分析,其中有40株抗性植株的PCR檢測為陽性,將PCR產物回收后,由北京華大基因有限公司進行序列測定。將測序成功的結果在美國國家生物技術信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站中進行序列對比與分析,我們利用Nucleotide Blast,成功鑒定13株轉Rev4基因的苜蓿植株。以外施濃度為8mmol/L的水楊酸誘導Rev4基因表達,通過半定量RT-PCR對轉化植株進行基因表達分析,確定抗菌肽Rev4基因在轉化植株中成功表達。本研究利用根癌農桿菌介導的紫花苜蓿種子整體侵染法,成功地將抗菌肽Rev4基因轉入紫花苜蓿,獲得13株轉基因株系,其中10株成功表達。該整體侵染法是本實驗室具有自主知識產權的專利技術,具有轉化率高、實驗周期短、實驗工作量少等優(yōu)點。轉抗菌肽苜蓿將大大提高苜�？共⌒�、抗蟲性以及產量,同時在動物飼料工業(yè)中將具有巨大的潛力與優(yōu)勢,轉抗菌肽Rev4的紫花苜蓿作為飼料可清除動物體內有害病毒、細菌及真菌,顯著降低腸道疾病發(fā)生,提高牲畜的抗病性以及提高肉質�？咕氖欠菍Ｒ坏拿庖邞鹞镔|,因此,抗菌肽將極大地減少產生耐藥性的可能。轉抗菌肽苜�？砂l(fā)展為綠色養(yǎng)殖專用飼料,這不僅具有重大的生態(tài)效益,同時具有巨大的經濟效益和社會效益。
【關鍵詞】：紫花苜蓿 整體侵染法 抗菌肽 分子鑒定
【學位授予單位】：吉林師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S541.9
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻綜述10-21
• 1.1 植物遺傳轉化研究進展10-13
• 1.1.1 植物遺傳轉化機制10
• 1.1.2 植物遺傳轉化方法10-13
• 1.2 苜蓿遺傳轉化研究進展13-16
• 1.2.1 苜蓿概述13-14
• 1.2.2 農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化機理14-15
• 1.2.3 農桿菌介導的苜蓿遺傳轉化的影響因素15-16
• 1.3 抗菌肽研究現狀16-21
• 1.3.1 抗菌肽簡介16-17
• 1.3.2 抗菌肽作用機制17-18
• 1.3.3 抗菌肽Rev4在植物遺傳轉化中的研究進展18-21
• 第二章 材料與方法21-26
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌種和質粒21
• 2.1.2 植物材料21
• 2.1.3 PCR擴增引物序列21
• 2.1.4 實驗試劑21-22
• 2.1.5 主要儀器設備22
• 2.1.6 培養(yǎng)基配方22-23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 紫花苜蓿整體轉化法體系23-24
• 2.2.1.1 菌種活化23
• 2.2.1.2 苜蓿種子消毒23-24
• 2.2.1.3 侵染24
• 2.2.1.4 共培養(yǎng)24
• 2.2.1.5 抗性轉化植株的獲得24
• 2.2.2 轉基因植株的分子鑒定24-26
• 2.2.2.1 總DNA的提取24
• 2.2.2.2 PCR擴增24
• 2.2.2.3 PCR產物的序列測定24-25
• 2.2.2.4 總RNA的提取25
• 2.2.2.5 RT-PCR25-26
• 第三章 結果與分析26-37
• 3.1 紫花苜蓿轉抗菌肽Rev4體系的建立26-27
• 3.1.1 紫花苜蓿種子整體侵染法26
• 3.1.2 轉抗菌肽基因抗性植株的獲得26
• 3.1.3 抗性植株的移栽26-27
• 3.2 轉基因植株的PCR鑒定27-28
• 3.2.1 紫花苜�；蚪M的提取27
• 3.2.2 抗菌肽基因的PCR鑒定27-28
• 3.3 PCR產物的序列測定3.4 轉化植株的半定量RT-PCR鑒定28-34
• 3.4 轉化植株的 RT-PCR 鑒定34-37
• 3.4.1 苜蓿總RNA提取34-35
• 3.4.2 RT-PCR分析35-37
• 第四章 討論37-40
• 4.1 紫花苜蓿種子整體侵染法37
• 4.2 抗菌肽基因pKLP36-PcRIL PCR程序的優(yōu)化37
• 4.3 PCR產物測序結果討論37-38
• 4.4 苜蓿RNA提取方案的優(yōu)化38-39
• 4.5 外源水楊酸誘導抗菌肽表達39-40
• 結論40-42
• 參考文獻42-48
• 攻讀碩士期間發(fā)表的主要科研成果48-50
• 后記50

【參考文獻】

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1 徐建;根癌農桿菌介導的F3’5’H基因對菊花遺傳轉化的初步研究[D];西南大學;2007年

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本文編號：717144