本文關(guān)鍵詞：南極微生物SOD基因克隆與表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化的研究

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【摘要】：南極具有獨(dú)特的地理及氣候特征,生存在其中的微生物,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,形成了極為獨(dú)特的基因資源、遺傳背景及新的代謝特征。南極微生物適應(yīng)極端環(huán)境的機(jī)理,挖掘和開(kāi)發(fā)其特殊功能基因是極端環(huán)境微生物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶,它可以清除對(duì)生物體有害的超氧陰離子自由基(O2.-),維持生物體內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡,從而防護(hù)自由基對(duì)機(jī)體的損傷,保證生物在氧脅迫環(huán)境下能夠正常生長(zhǎng),因此,SOD在生物抗逆適應(yīng)機(jī)制中扮演重要作用。本文從南極微生物Pseudoalteromonas sp.中利用簡(jiǎn)并引物通過(guò)PCR擴(kuò)增篩選出一株含SOD的菌株P(guān).sp.ANT506。將該目的基因(命名為Ps SOD)與p MD18-T載體連接,轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli DH5α,通過(guò)PCR擴(kuò)增及酶切驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行序列測(cè)定,獲得基因序列并利用生物信息學(xué)分析該P(yáng)s SOD的基本特性。分析表明,該P(yáng)s SOD基因具有完整的開(kāi)放閱讀框,大小為582bp,可編碼一個(gè)含193aa的蛋白質(zhì)。對(duì)Ps SOD推測(cè)的蛋白進(jìn)行理化特性分析,結(jié)果表明,該蛋白預(yù)計(jì)分子量(MW)為21.4k Da,等電點(diǎn)(p I)為5.09,是一種親水蛋白;蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,該蛋白由8個(gè)α-螺旋、3個(gè)β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲組成;蛋白保守結(jié)構(gòu)、SOD氨基酸序列的多序列比對(duì)與分析顯示Ps SOD蛋白屬于Mn/Fe SOD家族,保守區(qū)域氨基酸殘基為WEHAYY。該蛋白與Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 Fe-SOD的蛋白序列相似度最高,達(dá)97.9%;進(jìn)一步分析表明該P(yáng)s SOD蛋白為Fe-SOD,與金屬離子結(jié)合的氨基酸為His18、His74、His167和Asp162。將Ps SOD基因與p ET-28a(+)連接,并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3),篩選陽(yáng)性重組菌(命名為p ET-SOD),利用IPTG和降低培養(yǎng)溫度(28℃)方法誘導(dǎo)Ps SOD基因的異源表達(dá)。利用Ni-NTA純化重組蛋白(r Ps SOD)并利用SDSPAGE鑒定。結(jié)果顯示r Ps SOD大約為27k Da,其純化倍數(shù)達(dá)12.6倍,回收率22.9%,純化后的Ps SOD蛋白活性為587.4U/mg。r Ps SOD酶學(xué)特性研究表明,該酶的最適溫度為30℃,最適p H為8.0;在0℃可以檢測(cè)到最大酶活性的13.9%,相比其它金屬酶,r Ps SOD具有低溫催化活性和熱不穩(wěn)定性,為一種適冷酶。r Ps SOD經(jīng)2.5M Na Cl預(yù)處理后檢測(cè)到保持最大活性的62.4%,表明該蛋白具有一定的鹽脅迫耐受能力。r Ps SOD具有其酶學(xué)獨(dú)特性,可能與南極海冰低溫和高鹽的環(huán)境有關(guān)。利用Design-expert對(duì)p ET-SOD發(fā)酵表達(dá)r Ps SOD的培養(yǎng)基組分進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,乳糖、胰蛋白胨和吐溫-80是影響微生物生長(zhǎng)和r Ps SOD活性的主要因子。本文構(gòu)建了關(guān)于r Ps SOD活性的二次多元回歸模型,確定并驗(yàn)證了r Ps SOD活性最高時(shí)的發(fā)酵條件:0.047%吐溫-80,6.16g/L胰蛋白胨,11.38g/L乳糖,5g/L酵母粉,10g/L Na Cl,p H7.5,這將為SOD重組菌的大規(guī)模發(fā)酵提供重要參數(shù)。本論文通過(guò)對(duì)南極微生物中SOD的基因克隆、表達(dá)、酶學(xué)特性以及重組菌發(fā)酵工藝的系統(tǒng)研究,獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗逆基因資源,這為南極微生物來(lái)源的適冷酶的開(kāi)發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：南極微生物 SOD 適冷酶 克隆 表達(dá) 優(yōu)化
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q93;TQ925
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-22
• 1.1 課題背景10
• 1.2 SOD的研究進(jìn)展10-19
• 1.2.1 SOD的基本概念10-11
• 1.2.2 SOD的種類(lèi)和分布11-13
• 1.2.3 SOD的理化性質(zhì)13-15
• 1.2.4 SOD的催化機(jī)制15-16
• 1.2.5 SOD的作用及應(yīng)用現(xiàn)狀16-18
• 1.2.6 SOD的克隆與表達(dá)等研究18-19
• 1.3 兩極微生物的研究?jī)r(jià)值19
• 1.4 課題來(lái)源和研究的目的意義及內(nèi)容19-22
• 1.4.1 課題來(lái)源19-20
• 1.4.2 課題研究的目的及意義20
• 1.4.3 課題研究的主要內(nèi)容20-22
• 第2章 南極微生物SOD的克隆及生物信息學(xué)分析22-37
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 菌株22
• 2.1.2 培養(yǎng)基22
• 2.1.3 試劑22-23
• 2.2 方法23-28
• 2.2.1 含SOD基因海冰細(xì)菌的篩選23-25
• 2.2.2 PsSOD基因T-A克隆與生物信息學(xué)分析25-28
• 2.3 結(jié)果與討論28-36
• 2.3.1 菌株的篩選28-29
• 2.3.2 PsSOD的T-A克隆29-30
• 2.3.3 PsSOD基因的測(cè)序及其分析30-36
• 2.4 本章小結(jié)36-37
• 第3章 PsSOD基因的表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定37-56
• 3.1 材料37-38
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒37
• 3.1.2 試劑及配制37-38
• 3.2 方法38-45
• 3.2.1 表達(dá)菌株pET-SOD的構(gòu)建39-41
• 3.2.2 pET-SOD的異源表達(dá)及純化41-44
• 3.2.3 rPsSOD 蛋白的性質(zhì)測(cè)定44-45
• 3.3 結(jié)果與討論45-55
• 3.3.1 表達(dá)菌株pET-SOD的構(gòu)建46-48
• 3.3.2 rPsSOD的表達(dá)及純化48-51
• 3.3.3 rPsSOD的性質(zhì)研究51-55
• 3.4 本章小結(jié)55-56
• 第4章 重組pET-SOD大腸桿菌培養(yǎng)基組分的發(fā)酵優(yōu)化56-67
• 4.1 材料56-57
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株56
• 4.1.2 試劑及培養(yǎng)基56-57
• 4.2 方法57-59
• 4.2.1 菌株的活化及發(fā)酵57
• 4.2.2 rPsSOD酶液的制備及活性測(cè)定57
• 4.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基重要因子的篩選57-58
• 4.2.4 爬坡實(shí)驗(yàn)58
• 4.2.5 Box-Behnken Design最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)58-59
• 4.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)59
• 4.3 結(jié)果與討論59-66
• 4.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基重要因子的篩選59-61
• 4.3.2 爬坡實(shí)驗(yàn)61-62
• 4.3.3 Box-Behnken Design最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)62-65
• 4.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)65-66
• 4.4 本章小結(jié)66-67
• 結(jié)論67-69
• 參考文獻(xiàn)69-78
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其它成果78-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：652518