本文關(guān)鍵詞：基于高熒光碳點(diǎn)的免疫熒光探針的構(gòu)建及其在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 熒光抗體技術(shù) 免疫熒光探針 碳點(diǎn) 特異性 大腸桿菌O157:H7

【摘要】：目的:以檸檬酸為碳源,采用微波加熱一步法,制備表面經(jīng)鈍化劑修飾的熒光碳點(diǎn),通過(guò)優(yōu)化制備過(guò)程和反應(yīng)條件,達(dá)到高熒光量子產(chǎn)率,并研究其發(fā)光機(jī)理。將碳點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物和大腸桿菌抗體分子結(jié)合,構(gòu)建免疫熒光探針,以腸出血性大腸桿菌O157:H7為目標(biāo)檢測(cè)物,利用抗體-抗原特異性結(jié)合特性,觀察大腸桿菌樣本與探針結(jié)合后的熒光性,驗(yàn)證碳點(diǎn)在免疫熒光探針的構(gòu)建是否成功,探索碳點(diǎn)基免疫熒光探針在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用。期望制備一種低毒、經(jīng)濟(jì)、高效、穩(wěn)定的碳點(diǎn)作為免疫熒光探針的熒光標(biāo)記物,安全、高效地識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)物。內(nèi)容與方法:本論文擬在以下幾個(gè)方面開(kāi)展工作:(1)選擇無(wú)水檸檬酸為碳源,聚乙烯亞胺(PEI)為修飾劑,通過(guò)微波法直接合成表面氨基化的碳點(diǎn),無(wú)需再進(jìn)行表面修飾,合成熒光性能良好的熒光碳點(diǎn);系統(tǒng)研究微波時(shí)間、反應(yīng)物配比等合成條件對(duì)碳點(diǎn)的產(chǎn)率、結(jié)構(gòu)、組成、微觀形貌、粒徑大小及其分布的影響,揭示碳點(diǎn)的形成規(guī)律,進(jìn)行透射電鏡(TEM)、紅外光譜(FTIR)、熒光光譜(FL)、紫外吸收光譜(UV)等表征手段,分析其成分、結(jié)構(gòu)、形貌特征。(2)將碳點(diǎn)與大腸桿菌抗體通過(guò)酰胺化反應(yīng)化學(xué)偶聯(lián),形成免疫熒光探針;選擇與大腸桿菌類似的其他細(xì)菌作為對(duì)照模型,分析碳點(diǎn)與對(duì)照模型之間、免疫熒光探針與對(duì)照模型之間的相互作用及非特異吸附性能,研究免疫熒光探針的專一性。(3)探索基于碳點(diǎn)的免疫熒光探針在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用,建立大腸桿菌濃度與探針熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系,確定檢測(cè)限。結(jié)果:(1)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了PEI修飾的碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度比無(wú)PEI修飾的碳點(diǎn)明顯增強(qiáng),同時(shí)增加了碳點(diǎn)表面的氨基功能基團(tuán),使未來(lái)免疫熒光探針的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。表征結(jié)果顯示,碳點(diǎn)呈球形,粒徑分布范圍窄,平均粒徑3 nm,小于10 nm,粒徑小可以盡可能的減小對(duì)生物的干擾。碳點(diǎn)的熒光性能優(yōu)良,熒光量子產(chǎn)率達(dá)到了46.7%,略低于作為標(biāo)準(zhǔn)物的硫酸奎寧(熒光量子產(chǎn)率為54%),達(dá)到了較高的熒光量子產(chǎn)率。而且光穩(wěn)定性強(qiáng),可長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm時(shí),具有最強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,在440 nm左右。合成的碳點(diǎn)具有隨著激發(fā)波長(zhǎng)的紅移,發(fā)射波長(zhǎng)也隨之紅移的現(xiàn)象,在紫外光激發(fā)下發(fā)射藍(lán)色熒光,在藍(lán)色光激發(fā)下發(fā)射綠色熒光,在綠色光激發(fā)下發(fā)射紅色熒光,因此可用于多色熒光成像。實(shí)驗(yàn)對(duì)制備碳點(diǎn)過(guò)程中的原料配比、pH、微波時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化,碳點(diǎn)的最優(yōu)合成條件是無(wú)水檸檬酸和聚乙烯亞胺配比3:1,并且此時(shí)的溶液pH值為5,呈弱酸性,微波時(shí)間為10 min。獲得的碳點(diǎn)粒徑均勻,分布范圍窄,并且熒光性能優(yōu)良。(2)通過(guò)碳點(diǎn)與E.coli O157:H7孵育,利用粒徑小的優(yōu)勢(shì),通過(guò)細(xì)菌的內(nèi)吞作用,碳點(diǎn)進(jìn)入到了細(xì)菌的內(nèi)部,實(shí)現(xiàn)了對(duì)E.coli O157:H7的熒光標(biāo)記和成像,說(shuō)明了碳點(diǎn)具有好的生物相容性,能夠穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。此外,碳點(diǎn)對(duì)E.coli O157:H7的熒光標(biāo)記,可以產(chǎn)生多色熒光,在紫外、藍(lán)色和綠色光激發(fā)下,細(xì)菌呈現(xiàn)藍(lán)色、綠色和紅色熒光圖像。在未來(lái)的熒光成像應(yīng)用中,我們可以采用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光源,減少目標(biāo)標(biāo)記物自體熒光的干擾。采用MTT法測(cè)定了碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明即使在我們實(shí)驗(yàn)所用最高濃度1.2mg/mL時(shí),細(xì)胞仍然具有80%以上的存活率,充分表明碳點(diǎn)的低細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn)。(3)通過(guò)EDC/NHS偶聯(lián)法將氨基修飾的碳點(diǎn)和抗體共價(jià)結(jié)合,構(gòu)建了一種基于碳點(diǎn)的免疫熒光探針,使碳點(diǎn)這種新型的熒光納米材料成功應(yīng)用在了熒光抗體技術(shù)中。能夠在較短時(shí)間內(nèi)特異性的識(shí)別E.coli O157:H7,并且多色熒光成像。我們基于碳點(diǎn)構(gòu)建的免疫熒光探針能夠快速的檢測(cè)樣本中的E.coli O157:H7,檢測(cè)靈敏度達(dá)到103CFU/mL,并可在短時(shí)間內(nèi)(1 h)完成,可通過(guò)便攜式光譜儀實(shí)現(xiàn)野外環(huán)境下的快速偵檢。結(jié)論:我們成功制備了一種較高熒光量子產(chǎn)率的碳點(diǎn),比將其應(yīng)用到了熒光抗體技術(shù)中,構(gòu)建了免疫熒光探針,特異性地識(shí)別了E.coli O157:H7,并達(dá)到了較高的靈敏度。我們相信,在目前的不足和問(wèn)題解決之后,碳點(diǎn)作為一種新型的熒光納米材料,在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用一定會(huì)得到極大地推動(dòng),有望成為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型低毒生物傳感器,拓展至病毒和其他細(xì)菌微生物的檢測(cè),在理論和實(shí)際應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：熒光抗體技術(shù) 免疫熒光探針 碳點(diǎn) 特異性 大腸桿菌O157:H7
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446.6
【目錄】：

• 縮略詞表7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 緒論13-30
• 1.1 前言13-14
• 1.2 熒光碳點(diǎn)的概述14
• 1.3 碳點(diǎn)的制備14-19
• 1.3.1 自上而下法14-16
• 1.3.2 自下而上法16-19
• 1.4 碳點(diǎn)的性能19-21
• 1.4.1 結(jié)構(gòu)特性19
• 1.4.2 光學(xué)特性19-21
• 1.4.3 碳點(diǎn)的毒性和生物相容性21
• 1.5 碳點(diǎn)的應(yīng)用21-26
• 1.5.1 環(huán)境檢測(cè)21-23
• 1.5.2 生物成像23-24
• 1.5.3 光催化應(yīng)用24-25
• 1.5.4 其他應(yīng)用25-26
• 1.6 熒光抗體技術(shù)26-28
• 1.6.1 熒光抗體技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀26-27
• 1.6.2 碳點(diǎn)在熒光抗體技術(shù)中的應(yīng)用27-28
• 1.7 課題研究主要內(nèi)容28-30
• 第二章 微波法制備熒光碳點(diǎn)30-44
• 2.1 引言30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑和材料31
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 2.4.1 碳點(diǎn)的制備31-32
• 2.4.2 碳點(diǎn)的表征32-33
• 2.5 結(jié)果與討論33-42
• 2.5.1 碳點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表征33-34
• 2.5.2 碳點(diǎn)的紅外光譜表征34-35
• 2.5.3 碳點(diǎn)的紫外吸收光譜和熒光性能35-39
• 2.5.4 碳點(diǎn)性能影響因素39-42
• 2.6 本章小結(jié)42-44
• 第三章 碳點(diǎn)的細(xì)菌熒光成像和細(xì)胞毒性44-49
• 3.1 引言44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器44-45
• 3.3 實(shí)驗(yàn)試劑和材料45
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法45-46
• 3.4.1 E.coli O157:H7的培養(yǎng)45-46
• 3.4.2 碳點(diǎn)對(duì)E.coli O157:H7的熒光成像46
• 3.4.3 MTT細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)46
• 3.5 結(jié)果與討論46-48
• 3.5.1 碳點(diǎn)標(biāo)記E.coli O157:H7的熒光成像46-48
• 3.5.2 碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性48
• 3.6 本章小結(jié)48-49
• 第四章 免疫熒光探針的構(gòu)建及E.coli O157:H7的特異性識(shí)別與檢測(cè)49-58
• 4.1 引言49-50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器50
• 4.3 實(shí)驗(yàn)試劑和材料50-51
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 4.4.1 免疫熒光探針的構(gòu)建51-52
• 4.4.2 E.coli O157:H7的培養(yǎng)52
• 4.4.3 E.coli O157:H7的特異性識(shí)別52
• 4.4.4 E.coli O157:H7的濃度檢測(cè)52-53
• 4.5 結(jié)果與討論53-56
• 4.5.1 構(gòu)建的免疫熒光探針53-54
• 4.5.2 C-Abs對(duì)E.coli O157:H7的特異性識(shí)別54
• 4.5.3 C-Abs對(duì)E.coli O157:H7的濃度檢測(cè)54-56
• 4.6 本章小結(jié)56-58
• 第五章 總結(jié)與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 在學(xué)期間取得的成果及發(fā)表的代表性論著68-69
• 作者簡(jiǎn)歷69-70
• 致謝70-71

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 霍霞,徐錫金,陳耀文;激光掃描共聚焦顯微鏡熒光探針的選擇和應(yīng)用[J];激光生物學(xué)報(bào);1999年02期

2 鄒肇娥;王化遠(yuǎn);唐元清;;熒光探針的應(yīng)用[J];華西藥學(xué)雜志;1991年04期

3 范偉貞;馬杰;陳建平;林麗榕;黃榮彬;;識(shí)別細(xì)胞內(nèi)金屬離子的有機(jī)熒光探針研究進(jìn)展[J];化學(xué)試劑;2012年08期

4 田少敏,阮康成;核酸熒光探針新進(jìn)展[J];生命的化學(xué)(中國(guó)生物化學(xué)會(huì)通訊);1998年01期

5 陳偉;段武彪;賀春英;李桂平;;非對(duì)稱酞菁作為熒光探針的研究與展望[J];醫(yī)學(xué)信息;2005年12期

6 單玲玲;高貴珍;段紅;顧月清;;靶向性熒光探針在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用[J];光譜實(shí)驗(yàn)室;2013年04期

7 王水云,晏芳,彭賀新,鄭昌東,柏承文;熒光定量法測(cè)量平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的探討[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

8 ;我國(guó)學(xué)者開(kāi)發(fā)獨(dú)特?zé)晒馓结?實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞代謝輔酶實(shí)時(shí)拍錄[J];微創(chuàng)醫(yī)學(xué);2012年02期

9 胡文祥;惲榴紅;;藥物的熒光檢測(cè)探針——9--蒽酰氯的合成[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;1991年03期

10 楊頻，楊斌盛，慈云祥，，楊燕生;鑭系熒光探針在生物學(xué)與醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;1995年04期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 董小虎;劉志洪;蔡汝秀;;新型雙光子鈣離子熒光探針[A];第十屆中國(guó)化學(xué)會(huì)分析化學(xué)年會(huì)暨第十屆全國(guó)原子光譜學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

2 鄭小蘭;樊曉星;閆敏;孫丹;鄭洪;;一種新型高選擇性次氯酸熒光探針[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第27屆學(xué)術(shù)年會(huì)第09分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2010年

3 童愛(ài)軍;向宇;;熒光探針的設(shè)計(jì)合成及其在陰、陽(yáng)離子識(shí)別中的分析應(yīng)用[A];第八屆全國(guó)發(fā)光分析暨動(dòng)力學(xué)分析學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

4 楊秉勤;田敏;武祥龍;郭媛;史真;;蛋白標(biāo)記熒光探針的合成[A];第五屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2007年

5 曹立;陳文彬;席真;;基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針的設(shè)計(jì)合成及其性質(zhì)的研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第26屆學(xué)術(shù)年會(huì)化學(xué)生物分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2008年

6 朱浩;劉曉健;樊江莉;彭孝軍;;反應(yīng)型銅離子熒光探針[A];第六屆全國(guó)物理無(wú)機(jī)化學(xué)會(huì)議論文摘要集[C];2012年

7 張冠軍;王利民;張良;陳志俊;;基于高性能有機(jī)顏料功能化的熒光探針用于氟離子檢測(cè)[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)氟化學(xué)會(huì)議論文摘要集[C];2012年

8 李國(guó)平;江華;;一氧化氮熒光探針的設(shè)計(jì)合成及研究[A];全國(guó)第十六屆大環(huán)化學(xué)暨第八屆超分子化學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2012年

9 曹立俠;李沙瑜;楊國(guó)強(qiáng);;一種新型的關(guān)于氨基酸識(shí)別熒光探針的研究[A];第十三屆全國(guó)光化學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

10 白玉梅;劉淵;任桂佳;丁立平;房喻;;基于表面活性劑調(diào)控的熒光探針及其對(duì)爆炸物的傳感研究[A];第十三屆全國(guó)光化學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2013年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 樊麗;新型pH熒光探針的研究及其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用[D];山西大學(xué);2014年

2 劉景;有機(jī)熒光探針的構(gòu)建及生物傳感研究[D];山西大學(xué);2014年

3 彭夢(mèng)姣;一系列新型有機(jī)功能小分子熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及性質(zhì)研究[D];西北大學(xué);2015年

4 劉姝兟;若干低濃度無(wú)機(jī)離子的富集與檢測(cè)過(guò)程研究[D];蘭州大學(xué);2015年

5 王曉菊;雙組分熒光探針的構(gòu)建及對(duì)單糖和糖苷的檢測(cè)[D];山西大學(xué);2015年

6 張迪;Tk噸類熒光探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)合成與性能研究[D];鄭州大學(xué);2014年

7 邱琳;新型Fe~(3+)、Zn~(2+)熒光探針的設(shè)計(jì)與應(yīng)用[D];南京大學(xué);2014年

8 張衛(wèi)杰;基于AIE發(fā)光機(jī)理的腫瘤靶向成像及線粒體熒光探針在細(xì)胞自噬研究中的應(yīng)用[D];華中科技大學(xué);2015年

9 渠星宇;紅光/近紅外BODIPY類熒光探針的研究及應(yīng)用[D];南京大學(xué);2013年

10 王冕;檢測(cè)有毒有害離子的熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及其性質(zhì)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王正芳;新型含二氟硼結(jié)構(gòu)熒光探針的設(shè)計(jì)合成及其在生物活性物質(zhì)檢測(cè)與成像中的應(yīng)用[D];山東師范大學(xué);2012年

2 夏帥;合成羅丹明B類衍生物熒光探針及利用Smiles重排合成苯并VA嗪酮類血小板聚集抑制劑[D];西南大學(xué);2015年

3 彭文;基于香豆素的硫化氫/硫醇雙通道熒光探針的合成及其應(yīng)用[D];河北大學(xué);2015年

4 焦曉潔;基于新型熒光染料的小分子熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及性能研究[D];天津理工大學(xué);2015年

5 魏婷;基于萘二甲酸酐的熒光探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)合成及性質(zhì)研究[D];浙江理工大學(xué);2015年

6 查佳玉;新型熒光探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)合成及細(xì)胞成像研究[D];天津理工大學(xué);2015年

7 王麗娟;基于喹啉新型銅離子(Ⅱ)熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及其性能研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 余青祥;基于萘酰亞胺的熒光探針的合成及其檢測(cè)功能[D];華南理工大學(xué);2015年

9 陳少敏;基于鑭系金屬結(jié)合標(biāo)簽的熒光探針的發(fā)展與應(yīng)用[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢物理與數(shù)學(xué)研究所);2015年

10 張亞楠;檢測(cè)次氯酸的熒光探針合成與應(yīng)用[D];鄭州大學(xué);2015年

本文編號(hào)：632139