本文關(guān)鍵詞：GsCHX19基因?qū)φ貣|紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及新株系的培育，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國(guó)鹽堿地面積約9913萬(wàn)公頃,近年來(lái)還有逐步擴(kuò)大的趨勢(shì)。伴隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展,飼料與食用糧需求量大幅上升,而東北地區(qū)存在大面積鹽堿地土壤,也嚴(yán)重限制了糧食及畜牧業(yè)的發(fā)展。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)素有“牧草之王”的美譽(yù),它作為重要的飼料作物的同時(shí),也是改良土壤和保持水土的重要作物。隨著基因工程技術(shù)的利用與發(fā)展的日益成熟,轉(zhuǎn)基因苜蓿的研究同樣也有著良好的發(fā)展勢(shì)頭,其中,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿子葉節(jié)的方法,因其具有易操作,轉(zhuǎn)化效率高,外源基因整合拷貝數(shù)少等特點(diǎn),克服了傳統(tǒng)遺傳育種的缺點(diǎn),成為培養(yǎng)苜蓿抗逆性新品系中最有效的手段之一。培育耐鹽堿轉(zhuǎn)基因苜蓿可以充分利用我國(guó)鹽堿地資源,提高苜蓿產(chǎn)量,對(duì)發(fā)展畜牧業(yè)和改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。CHX(cation/H+exchanger)是植物體內(nèi)存在于細(xì)胞質(zhì)膜或液泡膜等細(xì)胞膜上,編碼Na+、K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一類基因家族。CHX基因家族屬于CPA(cation/proton antiporter)超家族。CPA超家族通過(guò)Na+、Li+或K+交換H+以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)離子和p H穩(wěn)態(tài)。原核生物及真核生物CPA超家族主要包括CPA1和CPA2兩類。植物體中的CPA1與細(xì)菌的NhaP具有很高的序列相似性,包括研究較為廣泛的NHX(Na+/H+exchanger)家族。相對(duì)研究較少的CPA2家族包括KEA(K+-efflux antiporter)和CHX,其中CHX與酵母KHA1及Synechocystis的NhaS4有很高的序列相似性。目前研究表明,CHX蛋白僅存在于高等植物中,約800個(gè)氨基酸,包括N末端約400殘基的疏水性Na+/H+交換器以及C末端約300~400的親水性結(jié)構(gòu)域。由于親水C末端不包含已知的保守結(jié)構(gòu)域,因此它的功能是未知的。但是并不是所有的CHX都具有這樣的特性。例如,預(yù)測(cè)來(lái)自細(xì)菌的NhaS4蛋白編碼715個(gè)氨基酸,實(shí)際上只編碼410個(gè)。本實(shí)驗(yàn)室前期已得到具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、在非生物脅迫反應(yīng)中起重要作用的Gs CHX19基因與pCAMBIA330035S植物表達(dá)載體連接,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紫花苜蓿,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)生物信息學(xué)方法及分子生物學(xué)方法確定得到新的耐鹽堿綜合改良苜蓿新品系。本研究為耐鹽堿轉(zhuǎn)基因苜蓿的培育,提供了重要的研究材料。主要研究結(jié)果如下:(1)GsCHX19基因的生物信息學(xué)分析鹽堿脅迫應(yīng)答基因Gs CHX19基因是本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中獲得,本研究所選用的CHX19基因來(lái)源于野生大豆堿脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),該基因在轉(zhuǎn)錄水平積極響應(yīng)堿脅迫的誘導(dǎo),推測(cè)其可能積極參與了堿脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑,在堿脅迫通路中具有重要的功能。通過(guò)生物信息學(xué)方法,對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、親疏水性、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能注釋等生物信息學(xué)分析,并預(yù)測(cè)其蛋白的結(jié)構(gòu)域,預(yù)測(cè)該基因上游啟動(dòng)子的滲透脅迫相關(guān)調(diào)控元件,為下一步研究提供依據(jù)。(2)GsCHX19基因?qū)ψ匣ㄜ俎５倪z傳轉(zhuǎn)化和抗性植株的獲得以肇東紫花苜蓿為受體材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將已得到具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、在非生物脅迫反應(yīng)中起重要作用的GsCHX19基因與pCAMBIA330035Su植物表達(dá)載體連接,對(duì)苜蓿進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化的受體為苜蓿子葉節(jié),通過(guò)再生體系獲得抗性植株20株。(3)轉(zhuǎn)GsCHX19基因抗性植株的分子生物學(xué)檢測(cè)對(duì)獲得的20株轉(zhuǎn)GsCHX19基因抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè),獲得PCR陽(yáng)性植株16株,PCR陽(yáng)性率為80%;對(duì)PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),獲得11株GsCHX19基因在轉(zhuǎn)錄水平上超量表達(dá)的植株,RT-PCR陽(yáng)性率為68.75%。
【關(guān)鍵詞】：苜蓿 GsCHX19基因 生物信息學(xué) 轉(zhuǎn)基因株系
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S541.9
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-22
• 1.1 本研究的目的與意義12
• 1.2 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1.2.1 植物耐鹽機(jī)制研究12-14
• 1.2.2 CHX基因家族的研究進(jìn)展14-15
• 1.2.3 苜�；蚬こ萄芯窟M(jìn)展15-17
• 1.2.4 生物信息學(xué)在植物生物工程中的應(yīng)用17-20
• 1.3 主要研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線20-22
• 1.3.1 本研究的課題來(lái)源20
• 1.3.2 本研究的主要內(nèi)容與技術(shù)路線20-22
• 2 材料與方法22-32
• 2.1 基于鹽堿脅迫野生大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的GsCHX19基因的篩選22
• 2.1.1 試驗(yàn)材料22
• 2.1.2 試驗(yàn)方法22
• 2.2 野生大豆鹽堿脅迫關(guān)鍵基因GsCHX19的生物信息學(xué)分析22-23
• 2.2.1 試驗(yàn)材料22
• 2.2.2 試驗(yàn)方法22-23
• 2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得23-27
• 2.3.1 試驗(yàn)材料23-25
• 2.3.2 試驗(yàn)方法25-27
• 2.4 轉(zhuǎn)基因抗性植株的分子生物學(xué)檢測(cè)27-32
• 2.4.1 試驗(yàn)材料27-28
• 2.4.2 試驗(yàn)方法28-32
• 3 結(jié)果與分析32-48
• 3.1 GsCHX19基因生物信息學(xué)分析32-41
• 3.1.1 GsCHX19基因分析32-33
• 3.1.2 GsCHX19蛋白序列的分析33-37
• 3.1.3 GsCHX19蛋白結(jié)構(gòu)域及功能預(yù)測(cè)37-39
• 3.1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析39-41
• 3.2 苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得培養(yǎng)41-44
• 3.2.1 植物表達(dá)載體pCAMBI A330035Su- Gs CHX 19轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌41-42
• 3.2.2 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得42-44
• 3.3 轉(zhuǎn)基因抗性植株的分子生物學(xué)檢測(cè)44-48
• 3.3.1 轉(zhuǎn)GsCHX19基因抗性植株的P CR檢測(cè)44-45
• 3.3.2 PCR陽(yáng)性植株的RT-P CR檢測(cè)45-46
• 3.3.3 Real- time PCR鑒定46-48
• 4 討論48-50
• 4.1 GsCHX19基因的生物信息學(xué)分析48
• 4.2 轉(zhuǎn)基因苜蓿培育與篩選48-49
• 4.3 下一步工作展望49-50
• 5 結(jié)論50-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文57

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊浩;GsCHX19基因?qū)φ貣|紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及新株系的培育[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：GsCHX19基因?qū)φ貣|紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化及新株系的培育，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：471807