鼠源噬菌體抗體展示庫的構(gòu)建及初步應(yīng)用
【圖文】：
Γ嘹曬┖笮鈃匝槭褂謾Ｓ捎冢塇A容易被自然環(huán)境中無處不在的ＲNAase降解，所以在提取和上樣檢測過程中要嚴(yán)格進(jìn)行ＲNAase酶消解處理。本試驗(yàn)中提取的總ＲNA也有部分降解的痕跡，可能是電泳上樣過程中被空氣中的ＲNAase降解了，所以電泳檢測過程中還需對環(huán)境和容器進(jìn)行更為嚴(yán)格的酶失活處理。2．2重鏈基因和輕鏈基因擴(kuò)增及ScFv基因拼接對重鏈基因和輕鏈基因進(jìn)行擴(kuò)增，先分別添加Linker序列，最后通過SOE-PCＲ將重鏈基因和輕鏈基因拼接為完整的ScFv基因，試驗(yàn)效果分別見圖2、圖3和圖4。從圖2、圖3和圖4中可以看出，，各圖1鼠脾臟細(xì)胞總ＲNAFig．1TotalＲNAextractionfromspleencellsofmousePCＲ產(chǎn)物(重鏈基因約340bp，輕鏈基因約320bp，重鏈-Linker基因約440bp，Linker-輕鏈基因約420bp，ScFv基因約750bp)經(jīng)DNA電泳檢測，均含有清晰的目的基因片段，表明各PCＲ試驗(yàn)都達(dá)到了預(yù)期效果，目的基因擴(kuò)增成功。2．3E．coliTG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備取1μlDNA濃度為0.1μg/μl的pCANTAB-5E噬菌粒載體，將其電轉(zhuǎn)化到制備的E．coliTG1感受態(tài)細(xì)胞中，按公式(1)算得電轉(zhuǎn)化效率為6．76×109，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到高效電轉(zhuǎn)要求。徐重新等:鼠源噬菌體抗體展示庫的構(gòu)建及初步應(yīng)用213
M:DNAmarker;1、3:輕鏈基因VL;2:重鏈基因VH。圖2重鏈基因、輕鏈基因PCＲ擴(kuò)增Fig．2PCＲamplificationofVHandVLM:DNAmarker;1、3:Linker-VL;2:VH-Linker。圖3重鏈基因和輕鏈基因添加Linker基因PCＲ擴(kuò)增Fig．3PCＲamplificationofVHandVLaddedLinkergeneM:DNAmarker;1、2:ScFv基因。圖4ScFv基因PCＲ擴(kuò)增Fig．4PCＲamplificationofScFvgene2．4噬菌體單鏈抗體展示庫構(gòu)建pCANTAB-5E噬菌粒載體提取并純化后，分別以NotI酶、SfiI酶進(jìn)行單酶切，以NotI酶和SfiI酶進(jìn)行雙酶切，經(jīng)DNA電泳跑膠(圖5)后，發(fā)現(xiàn)3種酶切方式處理的質(zhì)粒載體條帶均比未經(jīng)過酶切處理的質(zhì)粒大，表明在購買的噬菌粒載體中存在NotI酶和SfiI酶的酶切位點(diǎn)，且酶具有活性。將拼接好并且添加酶切位點(diǎn)基因擴(kuò)增的ScFv基因和pCANT-AB-5E噬菌粒載體酶切、酶連后，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入到E．coliTG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)系列梯度稀釋后涂板(圖6)。計算獲得初級噬菌體展示庫庫容量為3．67×108，隨機(jī)挑取12個單克隆菌種進(jìn)行PCＲ(圖7)和測序驗(yàn)證(表2)，發(fā)現(xiàn)所有供測菌種中均含有目的基因大小片段(約900bp，含克隆位點(diǎn)前后約150bp通用序列)，經(jīng)序列比對分析，證實(shí)均為小鼠抗體基因，且這些單克隆菌中ScFv基因的重鏈可變區(qū)基因、輕鏈可變區(qū)基因均存在或多或少差異。由此說明，試驗(yàn)中構(gòu)建的鼠源噬菌體展示庫庫容量較大，多樣性較豐富，初步確定達(dá)到預(yù)期試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。M:DNAmarker;1:pCANTAB-5E;2:pCANTAB-5E(經(jīng)NotI酶切);3:pCANTAB-5E(經(jīng)SfiI酶切);4:pCANTAB-5E(經(jīng)NotI、SfiI雙酶切)。圖5pCANTAB-5E噬菌粒載體酶切驗(yàn)證Fig．5TherestrictionenzymecuttingofpCANTAB-5EphagevectorA:原液(100μl);B:稀釋比例1×104(100μl);C:稀釋比例1×105(100μl);D:稀釋比例1×106(100μ
【作者單位】： 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31630061、31371778) 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題(49114063201604、49114063201608) 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院基金項(xiàng)目(6111676)
【分類號】：Q78
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