【摘要】：構建可用于特異性單鏈抗體(ScFv)篩選和應用的大容量鼠源噬菌體抗體展示庫,獲得擁有自主知識產權的抗體庫材料。從小鼠脾臟細胞中提取總RNA,反轉錄成c DNA后,分別擴增抗體的重鏈基因、輕鏈基因,并設計2條互補的Linker基因。采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)法將重鏈-Linker和Linker-輕鏈拼接為完整的ScFv基因,酶切、酶連后,將ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒載體上,經電穿孔導入E.coli TG1感受態(tài)細胞中,過夜培養(yǎng)獲得初級噬菌體展示庫。以單克隆菌落數計算庫容量大小,通過比對隨機挑取的單克隆噬菌體ScFv可變區(qū)序列的差異,分析庫的多樣性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)為包被抗原,從庫中篩選具有結合活性的ScFv驗證庫的實用性。經檢測,提取的總RNA條帶清晰,濃度為2.76μg/μl,擴增的抗體重鏈基因、輕鏈基因條帶清晰,且2條互補的Linker基因成功添加到重鏈基因和輕鏈基因上。經SOE-PCR法擴增,重鏈-Linker與Linker-輕鏈成功拼接為ScFv基因。電轉化后,經PCR(Polymerase chain reaction)擴增和凝膠電泳檢測,證實ScFv基因克隆成功,測得初級噬菌體抗體展示庫的庫容為3.67×10~8。隨機挑取12個單克隆菌種進行測序和比對,證實ScFv基因為鼠源抗體基因,且12個單克隆菌種的ScFv基因可變區(qū)均有一定差異,說明ScFv基因具有多樣性。以3種Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)為抗原,經4輪特異性富集篩選后均獲得了具有抗原結合活性的噬菌體ScFv菌種,表明該庫的實用性較強。
【圖文】：

Γ嘹曬┖笮鈃匝槭褂謾Ｓ捎冢塇A容易被自然環(huán)境中無處不在的ＲNAase降解，所以在提取和上樣檢測過程中要嚴格進行ＲNAase酶消解處理。本試驗中提取的總ＲNA也有部分降解的痕跡，可能是電泳上樣過程中被空氣中的ＲNAase降解了，所以電泳檢測過程中還需對環(huán)境和容器進行更為嚴格的酶失活處理。2．2重鏈基因和輕鏈基因擴增及ScFv基因拼接對重鏈基因和輕鏈基因進行擴增，先分別添加Linker序列，最后通過SOE-PCＲ將重鏈基因和輕鏈基因拼接為完整的ScFv基因，試驗效果分別見圖2、圖3和圖4。從圖2、圖3和圖4中可以看出，，各圖1鼠脾臟細胞總ＲNAFig．1TotalＲNAextractionfromspleencellsofmousePCＲ產物(重鏈基因約340bp，輕鏈基因約320bp，重鏈-Linker基因約440bp，Linker-輕鏈基因約420bp，ScFv基因約750bp)經DNA電泳檢測，均含有清晰的目的基因片段，表明各PCＲ試驗都達到了預期效果，目的基因擴增成功。2．3E．coliTG1電轉感受態(tài)制備取1μlDNA濃度為0.1μg/μl的pCANTAB-5E噬菌粒載體，將其電轉化到制備的E．coliTG1感受態(tài)細胞中，按公式(1)算得電轉化效率為6．76×109，轉化效率達到高效電轉要求。徐重新等:鼠源噬菌體抗體展示庫的構建及初步應用213

M:DNAmarker;1、3:輕鏈基因VL;2:重鏈基因VH。圖2重鏈基因、輕鏈基因PCＲ擴增Fig．2PCＲamplificationofVHandVLM:DNAmarker;1、3:Linker-VL;2:VH-Linker。圖3重鏈基因和輕鏈基因添加Linker基因PCＲ擴增Fig．3PCＲamplificationofVHandVLaddedLinkergeneM:DNAmarker;1、2:ScFv基因。圖4ScFv基因PCＲ擴增Fig．4PCＲamplificationofScFvgene2．4噬菌體單鏈抗體展示庫構建pCANTAB-5E噬菌粒載體提取并純化后，分別以NotI酶、SfiI酶進行單酶切，以NotI酶和SfiI酶進行雙酶切，經DNA電泳跑膠(圖5)后，發(fā)現3種酶切方式處理的質粒載體條帶均比未經過酶切處理的質粒大，表明在購買的噬菌粒載體中存在NotI酶和SfiI酶的酶切位點，且酶具有活性。將拼接好并且添加酶切位點基因擴增的ScFv基因和pCANT-AB-5E噬菌粒載體酶切、酶連后，電轉導入到E．coliTG1電轉感受態(tài)細胞中，經系列梯度稀釋后涂板(圖6)。計算獲得初級噬菌體展示庫庫容量為3．67×108，隨機挑取12個單克隆菌種進行PCＲ(圖7)和測序驗證(表2)，發(fā)現所有供測菌種中均含有目的基因大小片段(約900bp，含克隆位點前后約150bp通用序列)，經序列比對分析，證實均為小鼠抗體基因，且這些單克隆菌中ScFv基因的重鏈可變區(qū)基因、輕鏈可變區(qū)基因均存在或多或少差異。由此說明，試驗中構建的鼠源噬菌體展示庫庫容量較大，多樣性較豐富，初步確定達到預期試驗目標。M:DNAmarker;1:pCANTAB-5E;2:pCANTAB-5E(經NotI酶切);3:pCANTAB-5E(經SfiI酶切);4:pCANTAB-5E(經NotI、SfiI雙酶切)。圖5pCANTAB-5E噬菌粒載體酶切驗證Fig．5TherestrictionenzymecuttingofpCANTAB-5EphagevectorA:原液(100μl);B:稀釋比例1×104(100μl);C:稀釋比例1×105(100μl);D:稀釋比例1×106(100μ
【作者單位】： 江蘇省農業(yè)科學院食品質量安全與檢測研究所省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質量安全重點實驗室農業(yè)部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室;
【基金】：國家自然科學基金項目(31630061、31371778) 省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質量安全重點實驗室自主研究課題(49114063201604、49114063201608) 江蘇省農業(yè)科學院院基金項目(6111676)
【分類號】：Q78

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本文編號：2522940