【摘要】：我國(guó)是食用菌種植大國(guó)。食用菌多糖因其極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。鮑魚菇(Pleurotus abalonus Han, K.M.Chen et S.Cheng)為擔(dān)子菌類松茸科(Tricholomataceae)側(cè)耳屬,食用菇菌類。 目前,對(duì)鮑魚菇多糖的研究尚處初級(jí)階段,關(guān)于其化學(xué)特征和抗腫瘤研究少有報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)多種食用菌粗多糖進(jìn)行抗腫瘤篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn),鮑魚菇粗多糖有較好的抗腫瘤效應(yīng)。為了進(jìn)一步闡述鮑魚菇多糖的抗腫瘤作用,研究其構(gòu)-效關(guān)系,本研究擬對(duì)鮑魚菇多糖進(jìn)行提取分離純化,并深入研究其抗腫瘤機(jī)制。 本研究通過本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)優(yōu)化過的水提醇沉結(jié)合超聲輔助法得到鮑魚菇粗多糖,得率為3.34%。并進(jìn)一步通過Sevag除蛋白,活性炭吸附法脫色后,再經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱分離得到3個(gè)主要組分(對(duì)應(yīng)洗脫液分別為0,0.05,0.1M氯化鈉溶液)。經(jīng)G-100葡聚糖凝膠柱層析,所收集的3個(gè)組分均為均一組分,命名為PAP-1、PAP-2和PAP-3。通過MTT和LDH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相比PAP-1和PAP-2, PAP-3對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7有顯著的抗腫瘤作用,IC50為193μg/mL。對(duì)PAP-3進(jìn)行PMP柱前衍生化,結(jié)合HPLC-UV分析結(jié)果顯示,PAP-3是由8種單糖組成,其組分及相應(yīng)的摩爾百分比依次為甘露糖(Mannose,12.1%)、核糖(Ribose,10.4%)、鼠李糖(Rhamnose,3.1%)葡萄糖醛酸(Glucuronic Acid,2.7%)、半乳糖醛酸(Galacturonic Acid,6.7)、葡萄糖(Glucose,23.5%)、半乳糖(Galactose,19.2%)和阿拉伯糖(Ara,19.5%),其中半乳糖醛酸含量最高,達(dá)到41.7%,接下來是葡萄糖和半乳糖,含量分別為29.8%和14.6%。高效液相凝膠滲透法測(cè)得PAP-3的分子量為3.68x105Da。 對(duì)篩選得到的PAP-3抗腫瘤機(jī)制做了深入研究。DAPI染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAP-3引起MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂、凋亡小體等細(xì)胞凋亡特征,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到PAP-3引起MCF-7細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻,證實(shí)PAP-3可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。進(jìn)而通過流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V-FITC/PI染色法對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡做了定量檢測(cè),結(jié)果顯示200μg/mL的PAP-3作用MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后出現(xiàn)20.48%的早期凋亡和29.39%的晚期凋亡。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)PAP-3引起MCF-7細(xì)胞凋亡線粒體跨膜電位下降,Bax、P53蛋白表達(dá)增強(qiáng),Bcl-2表達(dá)減弱,Caspase-3/9和PARP被活化,說明PAP-3誘導(dǎo)凋亡途徑為線粒體內(nèi)源途徑。此外,細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PAP-3將細(xì)胞周期阻滯在S期。 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),伴隨PAP-3誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡和周期阻滯,細(xì)胞胞內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著升高。用超氧化物歧化酶(SOD)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理MCF-7,能夠顯著降低胞內(nèi)活性氧水平。當(dāng)用PAP-3作用于經(jīng)SOD和NAC處理過的MCF-7細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)PAP-3抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力和誘導(dǎo)凋亡的能力顯著性降低。這一發(fā)現(xiàn)表明,PAP-3是通過ROS的介導(dǎo)作用,從而發(fā)揮其抗腫瘤機(jī)制。 本研究從鮑魚菇提取分離純化得到3種均一多糖組分,篩選發(fā)現(xiàn)其中一種分子量為3.68x105Da的多糖組分PAP-3具有顯著的抗腫瘤效應(yīng),其抗腫瘤效應(yīng)是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用,凋亡途徑為線粒體途徑。ROS在PAP-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中起到了重要的介導(dǎo)作用。這一研究發(fā)現(xiàn)為開發(fā)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型食品功能因子或藥品提供理論依據(jù),發(fā)揮了其巨大的潛在的經(jīng)濟(jì)的與社會(huì)的效益。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2452412