【摘要】：禽呼腸孤病毒病是由禽呼腸孤病毒(Avian Reovirus, ARV)引起禽類的一類傳染病,感染率較高。自1954年首次從患慢性呼吸道疾病的肉用型雞的呼吸道內(nèi)分離到該病毒,隨后又從蛋雞、火雞和番鴨中分離到該病毒。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),ARV在雞群中流行相當(dāng)普遍,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失。但目前ARV毒株分離較少,所以對于ARV的生物學(xué)特性、遺傳進(jìn)化、致病性等方面的相關(guān)報道也較少見。ARV的結(jié)構(gòu)蛋白σB與aC是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要宿主保護(hù)性抗原,然而其抗原決定簇——表位信息仍不清楚。抗體檢測方法中,病毒中和實驗,瓊脂擴(kuò)散實驗等耗時耗力、敏感性低,ELISA試劑盒多為進(jìn)口,價格昂貴,尚無具有自主知識產(chǎn)權(quán)的國產(chǎn)ELISA試劑盒,不利于該病的防控。因此本研究致力于完成ARV毒株的生物學(xué)特性研究及診斷方法的建立。 為了解ARV的生物學(xué)特性,對本實驗室分離到的兩株ARV毒株(ARV10-JS01株和ARV10-HB02株)進(jìn)行了全基因組測序。序列分析結(jié)果表明：兩株病毒各個基因片段核苷酸同源性均在99.5%以上,與大部分的引起關(guān)節(jié)炎的ARV毒株核苷酸同源性較高,表明這兩株病毒均為關(guān)節(jié)炎型呼腸孤病毒。測定了兩個毒株的組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)和雞胚半數(shù)致死量(ELD50),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARV10-JS01分離株的組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(3.75x108)明顯高于ARV10-HB02(3.5x107),而ARV10-HB02分離株的雞胚半數(shù)致死量(6.63x107)要明顯高于ARV10-JS01分離株(1.12x106)。體外復(fù)制動力學(xué)分析顯示,ARV10-JSO1的復(fù)制速度較慢,但復(fù)制滴度顯著高于ARV10-HB02。說明兩株病毒在CEF上的復(fù)制特性存在顯著差異 σB和σC蛋白是ARV的兩個主要的外殼蛋白,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生群特異性中和抗體,σC與σB蛋白相互作用,在ARV的感染及其致病性上起重要的作用。為探究ARV10-JS01株和ARV10-HB02兩株病毒在抗原性上的差異,本實驗通過對兩蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化,分別制備了針對這兩個蛋白的單克隆體。利用肽掃描技術(shù)對抗σB單克隆抗體1F4和1H3-1的表位信息進(jìn)行研究,鑒定出兩個最小線性抗原表位21-26aa和32-38aa,兩表位序列在ARV毒株σB蛋白中相當(dāng)保守,而在番鴨和火雞呼腸孤病毒的σB蛋白序列間保守性較低且交叉反應(yīng)結(jié)果為陰性,說明這兩個線性表位為ARV特異性抗原表位；用抗σC單克隆抗體對ARV σC蛋白進(jìn)行掃描,45-54aa為其最小線性抗原表位,與國際標(biāo)準(zhǔn)毒S1133屬同一進(jìn)化分支的ARV毒株中該表位非常保守,而在其他分支ARV及DRV毒株間保守性較低且交叉反應(yīng)結(jié)果為陰性,表明該表位為S1133型特異性抗原表位。另外,將ARV10-JS01與ARV10-HB02分離株的抗原表位信息進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),兩株病毒σB和aC蛋白的抗原表位非常保守。對ARV σC與σB蛋白進(jìn)行抗原表位的鑒定,有利于進(jìn)一步闡明σC與aB蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,為建立以表位為基礎(chǔ)的抗原抗體診斷方法和開發(fā)表位疫苗奠定重要的理論基礎(chǔ)。 此外,利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了σB和σC蛋白,將純化后的重組GB和6C蛋白作為包被抗原,建立了檢測ARV抗體的ELISA方法。并通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳反應(yīng)程序。對該方法的特異性、符合率、敏感性、抗體消長規(guī)律等指標(biāo)進(jìn)行測定,結(jié)果表明其特異性好、敏感性高、與其他檢測方法符合率較高,對免疫雞抗體消長規(guī)律測定準(zhǔn)確,可應(yīng)用于ARV的流行病學(xué)調(diào)查及免疫監(jiān)測。 本研究完成了兩株ARV分離株的全序列測定及體外生物學(xué)特性分析,豐富了ARV的基因組序列信息。制備σB和σC蛋白單克隆抗體,篩選到2個σB抗原表位和1個σC抗原表位,為進(jìn)一步了解其抗原結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。以σB和σC蛋白為包被原,建立了用于ARV抗體檢測的ELISA方法,該方法各項檢測指標(biāo)良好,具有進(jìn)一步開發(fā)為商品化試劑盒的潛力,為ARV的流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測提供技術(shù)支撐。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2447548