【摘要】：基于肽質(zhì)量指紋譜(peptied mass fingerprinting, PMF)的微生物識(shí)別技術(shù)是近年來新興的微生物鑒定技術(shù)體系,自從布魯克公司的Biotyper系統(tǒng)面世以來,PMF技術(shù)不斷地在各個(gè)領(lǐng)域接受驗(yàn)證與評(píng)價(jià)。因商業(yè)化數(shù)據(jù)庫在高致病性的病原微生物相關(guān)信息方面的不足,致使許多病原無法識(shí)別或識(shí)別不理想；目前為止,沒有PMF用于病原分型與溯源的流行病學(xué)研究,而PMF快速、高通量的特性非常適合于傳染病預(yù)防與控制,有望成為有效的診斷工具。商業(yè)化參考譜數(shù)據(jù)庫主要基于歐洲病原建立,由于地域性因素,我國某些病原基本不識(shí)別或識(shí)別率低,并且數(shù)據(jù)庫缺乏高致病性病原,嚴(yán)重限制其在傳染病預(yù)防控制領(lǐng)域的應(yīng)用。我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基于PMF的微生物識(shí)別系統(tǒng)尚屬空白,國內(nèi)市場不斷被國外公司占據(jù),自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的識(shí)別軟件系統(tǒng)研發(fā)有關(guān)國家的重大利益與安全。因此,結(jié)合目前PMF的研究現(xiàn)狀,本課題擬對(duì)PMF技術(shù)條件標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與評(píng)價(jià)、基于PMF的流行病學(xué)、重組病原及體液病原檢測方法建立、自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)微生物識(shí)別系統(tǒng)開發(fā)等四部分進(jìn)行研究,推進(jìn)與實(shí)現(xiàn)PMF在傳染病預(yù)防控制領(lǐng)域的應(yīng)用。 在PMF技術(shù)條件標(biāo)準(zhǔn)化上,本研究確定,針對(duì)商業(yè)化的系統(tǒng),所有菌株都采用預(yù)提取法,除芽孢菌采用80%三氟乙酸提取,其它菌均采用乙醇/甲酸預(yù)法處理；液體培養(yǎng)的細(xì)菌采用一次PBS洗滌后預(yù)提法,可滿足敏感性與生物安全性的要求,確定現(xiàn)有PMF系統(tǒng)的檢測限為10000個(gè)細(xì)胞。在細(xì)菌傳代過程中,2,000～20,000Da小肽系列相對(duì)保守,即使有個(gè)別變化也不會(huì)影響依據(jù)整體肽系列匹配率的細(xì)菌識(shí)別判斷。因此,在構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)肽質(zhì)量參考譜時(shí),無需考慮菌株的代數(shù)。采用標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)條件,本研究構(gòu)建了31個(gè)屬、94(86種細(xì)菌、6種支原體、2種螺旋體)個(gè)種的1019株(細(xì)菌886、支原體64、螺旋體69)病原菌的肽質(zhì)量參考譜,屬、種識(shí)別能力分別提高了28.2%、42.3%。特異性研究揭示了基于PMF技術(shù)在屬、種水平上可能錯(cuò)誤識(shí)別的菌株,共涉及8個(gè)屬、25個(gè)種的病原菌；地域性分析指出10個(gè)具有地域性特征的病原。為PMF在臨床感染診斷、傳染病預(yù)防控制、食品安全、口岸質(zhì)檢等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。 針對(duì)PMF分型與溯源,本研究選用高自然變異性的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,HP)、基因組最小、分型簡單的肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, MP)以及16S rRNA核糖體分型的鉤端螺旋體(Leptospira)作為模式菌進(jìn)行基于PMF的分型研究,探索創(chuàng)建種更為快速、實(shí)用的分型技術(shù)。進(jìn)而,將PMF技術(shù)用于化膿性鏈球菌(streptococcus pyogenes, group A Streptococcus,GAS)引起的猩紅熱疫情爆發(fā)的流行病學(xué)實(shí)戰(zhàn)分析。本研究采用PMF技術(shù)將HP分為P1、P2兩個(gè)型別,確定了9個(gè)HP型別相關(guān)的特征肽。非標(biāo)定量分析共發(fā)現(xiàn)30個(gè)型別相關(guān)的差異蛋白,生物信息學(xué)分析顯示P1、P2型HP自身蛋白水平在趨化性、離子調(diào)控、雙組分系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)都有顯著的不同,勢必影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其作用將影響宿主細(xì)胞的增殖或凋亡而導(dǎo)致不同的病理趨勢,為后續(xù)的PMF型別作用的分子機(jī)制及與疾病的相關(guān)性研究提供了基礎(chǔ)。針對(duì)肺炎支原體,本研究構(gòu)建了遺傳算法(GA)數(shù)學(xué)模型區(qū)分1型和2型MP,其結(jié)果與p1基因分型完全一致。模型的敏感度、特異性均為100%。確定了7個(gè)具有型別區(qū)分能力的特征肽,提供了一系列用于制備MP快速分型試劑盒的生物標(biāo)志蛋白,并為MP PMF分型機(jī)制的揭示提供線索。針對(duì)鉤端螺旋體,采用基于PMF的MSP聚類分析將鉤端螺旋體按其致病性歸為兩大類,與16S rRNA參考方法分型結(jié)果完全一致。通過提取致病性、非致病性菌株的共性特征譜,本研究在Biotyper中引入了超級(jí)譜的概念,其致病性區(qū)分特異性為100%。采用Label-free技術(shù)共發(fā)現(xiàn)108個(gè)致病性相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究將PMF技術(shù)用于2011年猩紅熱疫情爆發(fā)�？焖贆z測了猩紅熱爆發(fā)區(qū)哈爾濱、青島、濟(jì)南的298例猩紅熱及咽峽炎病人咽拭子樣本的p溶血分離株,準(zhǔn)確地從157個(gè)疑似菌株中識(shí)別了127株GAS。PMF的測試周期比傳統(tǒng)的桿菌肽(BST)或API20縮短了36-48小時(shí),識(shí)別能力提高5.5%。菌株匹配參考譜的emm型別分布提示本次猩紅熱爆發(fā)主要由emm12型GAS引起的,與后續(xù)emm分型研究結(jié)果完全一致。因此,快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化高通量的模式,使PMF完全可以取代傳統(tǒng)的GAS分子分型方法,用于猩紅熱的臨床診斷和疫情監(jiān)測。 針對(duì)新發(fā)病原與人工改造微生物的檢測,本研究將PMF技術(shù)用于克隆表達(dá)重組菌的識(shí)別,建立一種克隆表達(dá)過程中各階段表達(dá)體的快速分類識(shí)別方法。通過構(gòu)建四維分類數(shù)學(xué)模型,將克隆表達(dá)過程的重組病原分階段識(shí)別。最優(yōu)GA模型的交叉驗(yàn)證及識(shí)別能力評(píng)價(jià)分別為98.7%、100%,數(shù)據(jù)驗(yàn)證的準(zhǔn)確率為95%。采用表達(dá)鼠疫蛋白的重組子構(gòu)建的分類模型對(duì)空腸彎曲菌、幽門螺桿菌的重組子具有同樣的分類識(shí)別能力,是一種通用的模型。針對(duì)體液中病原檢測的現(xiàn)狀,本研究以布魯氏菌菌血樣本為例,采用PMF構(gòu)建了布魯氏菌特征肽質(zhì)量指紋譜模型,確定了8個(gè)特征指紋肽。用該模型檢測32例疑似臨床病人的菌血,10例為布魯氏菌陽性,與Tb噬菌體特異裂解實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 本研究所構(gòu)建的病原肽質(zhì)量譜數(shù)據(jù)庫成功用于我國第一套具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的PMF微生物識(shí)別軟件——微生物檢測系統(tǒng)(簡稱MicroID系統(tǒng)或微檢系統(tǒng))(version1.0)的研發(fā)和應(yīng)用。 總之,本研究進(jìn)行PMF技術(shù)條件的標(biāo)準(zhǔn)化、批量構(gòu)建病原微生物參考譜并進(jìn)行系統(tǒng)分析,并將構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫成功用于我國第一套具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的PMF微生物識(shí)別系統(tǒng)。探索了基于PMF的病原微生物分型方法,并將PMF技術(shù)用于實(shí)際疫情爆發(fā)處理中,為PMF技術(shù)在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的使用提供了方法、理論依據(jù)和范例。同時(shí)創(chuàng)造性地將PMF技術(shù)用于重組病原的識(shí)別、體液中病原體的快速檢測,構(gòu)建了切實(shí)可行的方法。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R446.5
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本文編號(hào)：2445964