【摘要】：小麥谷朊蛋白是一種非常有潛力的制備生物活性肽的植物蛋白源,其酶解產(chǎn)物可通過顯著地抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性,而達(dá)到降低血壓的目的。但由于谷朊蛋白遇水易交聯(lián)形成粘彈性強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)且分散性極差導(dǎo)致其酶解效率低。超聲波預(yù)處理底物蛋白可以通過改變蛋白的結(jié)構(gòu)而提高蛋白的酶解效率,但是超聲波預(yù)處理過程中底物蛋白結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化以及與酶解效率的關(guān)系還尚不清楚。超聲波預(yù)處理過程和蛋白酶解反應(yīng)過程還無法實(shí)現(xiàn)原位在線的監(jiān)測和終點(diǎn)的快速判斷。本文旨在通過多模式超聲波預(yù)處理提高谷朊蛋白的酶解效率,建立超聲波預(yù)處理過程中蛋白結(jié)構(gòu)變化與酶解產(chǎn)物活性的定量分析模型;通過原位實(shí)時(shí)光譜技術(shù),在超聲波預(yù)處理環(huán)節(jié)監(jiān)測谷朊蛋白受超聲波影響巰基(-SH)和二硫鍵(S-S)含量的變化規(guī)律,并在酶解反應(yīng)環(huán)節(jié)監(jiān)測谷朊蛋白的水解度(DH)、多肽濃度、ACE抑制率等主要指標(biāo)的變化規(guī)律。主要研究結(jié)果如下:(1)以谷朊蛋白的DH和酶解產(chǎn)物的ACE抑制率為指標(biāo),研究了多模式超聲波預(yù)處理對谷朊蛋白酶解特性的影響,得出超聲波最佳工作模式和預(yù)處理參數(shù)。在改善谷朊蛋白酶解效果方面,同步雙頻工作模式優(yōu)于單頻工作模式,而交替雙頻工作模式又優(yōu)于同步雙頻工作模式。在最優(yōu)的交替雙頻工作模式下,超聲波最佳預(yù)處理參數(shù)為:頻率組合20-35 kHz、交替時(shí)間5 s、超聲功率密度200 W/L、物料初始溫度30℃、料液濃度30 g/L、超聲處理時(shí)間10 min。經(jīng)交替雙頻超聲預(yù)處理后,谷朊蛋白的DH為12.51%、ACE抑制率為80.03%、IC50值為0.696mg/mL、蛋白轉(zhuǎn)化率為75.4%。與未經(jīng)超聲波預(yù)處理的對比,交替雙頻超聲預(yù)處理使得谷朊蛋白的DH提高了2.37%、ACE抑制率提高了19.30%、IC50值下降了6.5%。通過研究交替雙頻超聲波預(yù)處理對酶解過程的影響發(fā)現(xiàn),超聲波預(yù)處理可以使得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率提前10 min達(dá)到其最大值。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要為超聲波預(yù)處理在酶解反應(yīng)的前期提高了分子量在200~1000 Da多肽的含量。(2)利用原子力顯微鏡、紅外光譜等技術(shù)手段,研究了超聲波頻率、功率密度和預(yù)處理時(shí)間對谷朊蛋白表面微觀結(jié)構(gòu)(微觀形貌和表面粗糙度)、納米力學(xué)特性(楊氏模量和黏附力)、分子結(jié)構(gòu)(巰基含量-SH、二硫鍵含量S-S、表面疏水性H0和二級結(jié)構(gòu))的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):超聲波破壞了谷朊蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),適當(dāng)?shù)某暡A(yù)處理使得蛋白分子分布更加均勻,表面粗糙度變大;過長的預(yù)處理時(shí)間(10min)或者過大的超聲波預(yù)處理功率密度(200w/l)又使得蛋白分子重新聚集折疊,表面粗糙度也有所下降,不利于蛋白分子的酶解;超聲波預(yù)處理使得蛋白表面的納米力學(xué)特性重新分布,蛋白表面的平均楊氏模量和平均黏附力下降;超聲波預(yù)處理均使得谷朊蛋白的-sh含量、s-s含量、h0、二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,主要體現(xiàn)為-sh、s-s、h0的提高和α-螺旋含量減少。(3)通過皮爾森相關(guān)性分析、主成分分析、逐步多元線性回歸分析等方法,研究了超聲預(yù)處理過程中底物蛋白結(jié)構(gòu)表征與酶解產(chǎn)物ace抑制率的關(guān)系。相關(guān)性分析顯示,谷朊蛋白的-sh含量、表面粗糙度(ra,rq)、h0與蛋白酶解產(chǎn)物的ace抑制率有顯著(p0.05)的正相關(guān)關(guān)系,-螺旋、平均楊氏模量、黏附力與蛋白酶解產(chǎn)物的ace抑制率在有顯著(p0.05)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。主成分分析選取了3個(gè)主成分表示原始各結(jié)構(gòu)含量在樣品中的79.628%的信息。第一主成分為蛋白的-sh含量、平均黏附力、ra、rq、h0;第二主成分主要為β-折疊和無規(guī)則卷曲;第三主成分主要為蛋白質(zhì)的s-s含量。α-螺旋與蛋白的楊氏模量和黏附力有很高的相關(guān)程度。逐步回歸分析方程所建立的方程為ace抑制率=86.361+6.841(-sh)-0.687(α-螺旋)-0.162(s-s),r2為0.9380此方程可以用來反映谷朊蛋白酶解底物結(jié)構(gòu)表征與產(chǎn)物ace抑制率之間的定量關(guān)系。(4)建立了谷朊蛋白超聲波預(yù)處理過程的原位實(shí)時(shí)光譜監(jiān)測系統(tǒng)和光譜采集方法,可以穩(wěn)定地采集到超聲波預(yù)處理過程中谷朊蛋白的原位近紅外光譜信息。對超聲波預(yù)處理過程中的原位光譜進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(snv)、多元散射校正(msc)、一階導(dǎo)數(shù)(1stderivative)和二階導(dǎo)數(shù)(2ndderivative)四種方法的預(yù)處理。權(quán)衡考慮校正模型和預(yù)測模型的相關(guān)系數(shù)和均方根誤差大小,篩選出最優(yōu)子區(qū)間。在最優(yōu)光譜區(qū)間的基礎(chǔ)上研究原位實(shí)時(shí)光譜反應(yīng)系統(tǒng)結(jié)合線性模型聯(lián)合區(qū)間最小二乘法(si-pls)和誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(bp-ann)建立超聲波預(yù)處理過程中-sh、s-s含量的校正模型。結(jié)果顯示,最佳的光譜預(yù)處理方法為snv。-sh含量的最佳聯(lián)合區(qū)間為869~947、1207~1284、1458~1536和2205~2274nm。s-s的最佳區(qū)間為933~992、1388~1446、2091~2148和2217~2274nm。在最優(yōu)區(qū)間的基礎(chǔ)上非線性模型si-bp-ann的預(yù)測效果優(yōu)于線性模型si-pls。最終,對于-sh含量,預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)rp為0.9113,均方根誤差rmsep為0.38μmol/g。對于S-S含量,預(yù)測集的Rp為0.7523,均方根誤差RMSEP為6.56μmol/g。(5)建立了谷朊蛋白酶解過程的原位實(shí)時(shí)光譜監(jiān)測系統(tǒng)和光譜采集方法。對酶解液的近紅外光譜進(jìn)行了SNV、MSC、1st Derivative和2nd Derivative四種方法的預(yù)處理。利用聯(lián)合區(qū)間最小二乘法Si-PLS建立模型,以模型的相關(guān)系數(shù)和均方根誤差作為衡量指標(biāo),篩選出了建模的最佳光譜區(qū)間。結(jié)果顯示,SNV預(yù)處理后光譜的建模效果最好。DH的最佳聯(lián)合區(qū)間為1129.1~1200.4、1439.2~1509.9、1976.3~2046.2和2128.6~2198.2 nm;多肽濃度的最佳聯(lián)合區(qū)間為1586.9~1644.6、1766.1~1817.1、2166.6~2217.2和2337.2~2387.7 nm;ACE抑制率的最佳聯(lián)合區(qū)間為1168.0~1252.1、1798.0~1880.9、1887.2~1969.9和2337.2~2412.9 nm。利用最佳光譜區(qū)間建立了谷朊蛋白DH、酶解液多肽濃度和ACE抑制率的Si-PLS回歸模型。DH預(yù)測模型的Rp為0.9570,RMSEP為1.73%;多肽濃度預(yù)測模型的Rp為0.9840,RMSEP為0.79 mg/mL;ACE抑制率預(yù)測模型的Rp為0.9536,RMSEP為5.12%。以上研究結(jié)果表明:交替雙頻超聲波預(yù)處理可以顯著地提高谷朊蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率。酶解產(chǎn)物ACE抑制率的提高主要是由于超聲波預(yù)處理提高了-SH含量、降低了谷朊蛋白的-螺旋相對百分含量、平均楊氏模量和平均黏附力,其中-SH含量的提高對ACE抑制率的貢獻(xiàn)最大。近紅外原位實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)結(jié)合Si-BP-ANN模型可以很好地適用于超聲波預(yù)處理過程中谷朊蛋白-SH、S-S含量的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測;近紅外原位實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)結(jié)合Si-PLS建模方法可以同時(shí)監(jiān)測谷朊蛋白酶解過程中的DH、多肽濃度和ACE抑制率的動態(tài)變化。研究成果為開發(fā)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的超聲波預(yù)處理制備ACE抑制肽的原位實(shí)時(shí)監(jiān)測裝備提供理論基礎(chǔ)和方法借鑒。
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【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.2
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本文編號：2331607