本文選題：間尼索地平 + 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：間尼索地平(m-nisoldipine)[化學(xué)名稱(chēng):1,4-二氫-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸甲酯異丁酯]是由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院首次合成,具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類(lèi)新型二氫吡啶類(lèi)藥物,存在一個(gè)手性中心,可拆分為兩個(gè)光學(xué)對(duì)映體(R,S-m-nisoldipine)。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,該化合物具有抑制血管平滑肌收縮和擴(kuò)張血管的藥理活性,在心血管系統(tǒng)和血流動(dòng)力學(xué)方面表現(xiàn)出顯著的療效。前期藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,僅有少量原型藥物經(jīng)糞便和膽汁排泄,且尿中未檢出,提示間尼索地平主要以代謝物的形式排出體外,原型藥物排泄較少,此外目前的研究主要針對(duì)的是間尼索地平的消旋體,而對(duì)其對(duì)映體較少涉及。因此有必要對(duì)間尼索地平及其手性對(duì)映體的體內(nèi)外代謝情況進(jìn)行系統(tǒng)的研究。肝臟是體內(nèi)Ⅰ相和Ⅱ相代謝的最主要器官,是藥物體內(nèi)處置的重要場(chǎng)所。由于肝臟中的細(xì)胞色素CYP450酶是參與藥物代謝和生物活化的主要酶類(lèi),因此藥物與CYP450酶相互作用的研究,以及藥物對(duì)于CYP450酶的影響的研究就變得很有必要,同時(shí)該類(lèi)研究也為藥物聯(lián)合治療的作用機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。由于大部分藥物經(jīng)由CYP450代謝,當(dāng)藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)發(fā)生的藥物相互作用是由于一種藥物通過(guò)誘導(dǎo)或抑制酶特定的亞型,從而影響了另一種藥物的代謝特征,導(dǎo)致藥物的相互作用。因此對(duì)于一種新化學(xué)實(shí)體而言,有必要對(duì)此方面進(jìn)行研究,而間尼索地平在此方面的相關(guān)研究尚屬空白。由于HPLC/MS的高靈敏度和高選擇性,該方法被廣泛應(yīng)用于藥物在體內(nèi)的定量和定性分析研究。鑒于藥物代謝本身的復(fù)雜性及其潛在的藥物-藥物相互作用,HPLC/MS方法已成為主要的藥代動(dòng)力學(xué)和CYP450酶的研究手段。本研究基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和多種體內(nèi)外模型,系統(tǒng)研究間尼索地平及其光學(xué)對(duì)映體的體內(nèi)外代謝輪廓及其代謝表型;采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù),借助本研究建立的特異性體外cyp450酶探針檢測(cè)方法,基于人肝癌細(xì)胞系hepg2和人肝微粒體代謝模型,系統(tǒng)分析了基于cyp450酶的間尼索地平手性對(duì)映體潛在的藥物-藥物相互作用(ddi);采用hplc-ms聯(lián)用技術(shù),以大鼠作為研究對(duì)象,通過(guò)本研究建立的體內(nèi)cyp450酶探針檢測(cè)方法,系統(tǒng)分析了在不同劑量下,長(zhǎng)期給予間尼索地平對(duì)肝藥酶的影響。第一部分基于hplc-q-trap/ms技術(shù)的間尼索地平對(duì)映體的代謝表型研究目的:本研究基于高效液相色譜-四級(jí)桿-線性離子阱質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(hplc-q-trap/ms),采用cyp450酶亞型選擇性抑制劑,研究主要參與間尼索地平對(duì)映體在大鼠肝微粒體中代謝轉(zhuǎn)化的cyp450酶亞型。方法:將間尼索地平和cyp450酶各亞型特異性抑制劑加入大鼠肝微粒體溫孵液中共孵育,溫孵條件基于前期報(bào)道并進(jìn)行優(yōu)化,溫孵一定時(shí)間后,通過(guò)與不加入化學(xué)抑制劑的陰性對(duì)照溶液比較,檢測(cè)間尼索地平對(duì)映體的剩余量,考察化學(xué)抑制劑對(duì)間尼索地平對(duì)映體代謝的影響。結(jié)果:酮康唑(cyp3a特異性抑制劑)能顯著的抑制r,s兩種間尼索地平對(duì)映體的代謝,當(dāng)其濃度達(dá)到100μmol/l,對(duì)兩種間尼索地平對(duì)映體代謝的抑制率均達(dá)到最大,而其他cyp450特異性抑制劑對(duì)間尼索地平對(duì)映體的代謝均無(wú)明顯的抑制作用。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠肝微粒體中,cyp3a為間尼索地平對(duì)映體的主要代謝酶。第二部分基于uhplc-q-tof-ms/ms技術(shù)的間尼索地平對(duì)映體體外代謝研究目的:基于超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(uhplc-q-tof),采用大鼠肝微粒體作為體外代謝反應(yīng)模型,探討間尼索地平對(duì)映體的體外代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程。方法:將同等濃度的間尼索地平r,s對(duì)映異構(gòu)體分別置于體系中孵育。孵育完全后,將處理好的樣品注入到uhplc-q-tof-ms/ms色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。借助采集到的高分辨一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù),推測(cè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),闡述其代謝途徑并比較其異同。結(jié)果:通過(guò)與空白樣品比較,結(jié)合對(duì)照品的裂解規(guī)律,共從溫孵樣品中共鑒定出34個(gè)代謝產(chǎn)物,其中r-間尼索地平樣品中鑒定出18種代謝產(chǎn)物,s-間尼索地平樣品中鑒定出16種代謝產(chǎn)物。結(jié)論:通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物的歸納總結(jié),得到了間尼索地平的體外代謝規(guī)律,主要包括氧化反應(yīng)、去氫反應(yīng)和酯水解反應(yīng)等。第三部分基于體外模型的間尼索地平對(duì)映體對(duì)人肝cyp450酶的影響目的:基于hepg2細(xì)胞系及人肝微粒體代謝體系,研究間尼索地平對(duì)映體對(duì)人肝細(xì)胞色素氧化酶cyp450主要亞型cyp1a2、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、cyp3a4的誘導(dǎo)或抑制作用。方法:采用hepg2細(xì)胞株,加入不同濃度的間尼索地平對(duì)映體共溫孵,采用real-timepcr技術(shù)考察間尼索地平對(duì)映體對(duì)cyps的mrna表達(dá)的影響;參考fda相關(guān)指導(dǎo)原則,采用cyp450酶特異性探針底物的特征代謝反應(yīng),建立了基于lc-ms的探針底物代謝物檢測(cè)方法,用于間尼索地平對(duì)映體的體外抑制研究。結(jié)果:real-timepcr結(jié)果表明,與陰性對(duì)照組相比,在上述3種質(zhì)量濃度下,r,s-間尼索地平對(duì)映體均對(duì)cyp1a2具有明顯的誘導(dǎo)作用(p0.05)。r,s-間尼索地平對(duì)映體均對(duì)cyp2b6具有明顯的抑制作用(p0.05)。在低濃度下,r,s-間尼索地平對(duì)映體均對(duì)cyp3a4具有明顯的誘導(dǎo)作用(p0.05),但在中高濃度下,r-間尼索地平對(duì)映體均對(duì)cyp3a4具有明顯的誘導(dǎo)作用(p0.05),而在中高濃度下,s-間尼索地平對(duì)映體對(duì)cyp3a4無(wú)明顯作用。r,s-間尼索地平對(duì)映體均對(duì)cyp2d6無(wú)明顯作用。探針底物抑制結(jié)果表明,r,s-間尼索地平對(duì)映體均對(duì)cyp2c8、cyp2c9、cyp2d6、cyp3a4具有中等程度的抑制作用,而對(duì)cyp1a2、cyp2b6、cyp2c19沒(méi)有抑制作用。結(jié)論:間尼索地平對(duì)映體可能會(huì)對(duì)cyp450代謝酶產(chǎn)生影響,聯(lián)合用藥時(shí)應(yīng)加以關(guān)注。第四部分基于uhplc-q-tof-ms/ms的間尼索地平體內(nèi)代謝輪廓研究目的:分析間尼索地平在大鼠體內(nèi)的代謝物,研究間尼索地平及其代謝物在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律,從而闡明間尼索地平的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化途徑。方法:首先應(yīng)用uhplc-q-tof-ms/ms方法分析間尼索地平原藥及已知代謝產(chǎn)物對(duì)照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律及色譜保留時(shí)間,以此作為間尼索地平大鼠體內(nèi)代謝物分析鑒定的依據(jù);健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,灌胃給予間尼索地平,給藥劑量為10 mg/kg,給藥后采用代謝籠收集尿液和糞便。采用液液萃取方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,將處理好的樣品注入到UHPLC-Q-TOF-MS/MS儀,以多種數(shù)據(jù)采集模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集;通過(guò)獲得的代謝物質(zhì)譜信息,采用多種數(shù)據(jù)后處理策略推測(cè)及確認(rèn)代謝物結(jié)構(gòu),根據(jù)得到的代謝物結(jié)構(gòu)和類(lèi)型闡明間尼索地平在大鼠體內(nèi)的代謝途徑。結(jié)果:通過(guò)與空白樣品比較,結(jié)合對(duì)照品的裂解規(guī)律,從樣品中共鑒定出25個(gè)代謝產(chǎn)物。結(jié)論:該實(shí)驗(yàn)反映了間尼索地平的體內(nèi)代謝規(guī)律,間尼索地平的主要代謝途徑包括氧化反應(yīng)、去氫反應(yīng)、酯水解反應(yīng),還原反應(yīng)和甲基化反應(yīng)等。第五部分基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的間尼索地平對(duì)大鼠肝臟CYP450酶活性的影響目的:采用cocktail探針底物法,研究間尼索地平對(duì)大鼠肝細(xì)胞色素氧化酶CYP450亞型CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1、CYP3A1活性的影響。方法:建立基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)的體內(nèi)探針底物檢測(cè)方法;將SD大鼠隨機(jī)分成空白組、間尼索地平低、中、高劑量組。采用CMC-Na溶液配制間尼索地平低、中、高劑量溶液,灌胃給藥,1日1次,連續(xù)15天。并建立基于LC-MS的體內(nèi)探針底物檢測(cè)方法,通過(guò)給予低劑量探針?biāo)幬?測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),間接考察間尼索地平對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞色素CYP450酶的影響。結(jié)果:建立的體內(nèi)探針檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng);研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的間尼索地平長(zhǎng)期給藥后對(duì)大鼠CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1和CYP3A1代謝酶的活性具有顯著影響。結(jié)論:長(zhǎng)期給予間尼索地平可能會(huì)對(duì)CYP450代謝酶產(chǎn)生影響,聯(lián)合用藥時(shí)應(yīng)加以關(guān)注。
[Abstract]:闂村凹绱㈠湴騫，

本文編號(hào)：1981719