本文選題：心力衰竭 + 非黃嘌呤類A_1R阻斷劑��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2013年博士論文

【摘要】：心力衰竭（Heart failure, HF）是高血壓、冠心病、心肌病、心瓣膜病等各種心臟病的嚴(yán)重階段，是眾多心血管疾病的終末轉(zhuǎn)歸。心力衰竭病人已經(jīng)成為心血管疾病臨床住院病人的主要來源，其發(fā)病率高，5年存活率低，與惡性腫瘤相仿。心力衰竭的治療已經(jīng)成為病人、醫(yī)生和醫(yī)療保健系統(tǒng)的重荷。 有效的治療心力衰竭對降低心血管疾病的致殘率、致死率都具有重要的意義。目前心力衰竭的常規(guī)藥物治療是聯(lián)合使用3大類藥物，即利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor, ACEI）和β受體阻滯劑。利尿劑在心力衰竭治療中起著基礎(chǔ)和關(guān)鍵的作用，其控制和緩解心力衰竭癥狀“立竿見影”，是其他任一有效“生物學(xué)治療”的基礎(chǔ)。目前，在心力衰竭治療中使用的經(jīng)典利尿劑在發(fā)揮利尿作用的同時(shí)常常會引起低血壓、以低鉀血癥為代表的電解質(zhì)紊亂和降低腎血流量和降低腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate,GFR），誘發(fā)或加重腎功能損害，最終影響到對心力衰竭的臨床治療效果，甚至威脅到病人的生命。因此，具有良好利尿作用并能維持電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)、且具有保護(hù)心力衰竭患者腎功能的新型利尿藥物成為利尿藥研發(fā)的重要方向。近年來，隨著對心力衰竭病理生理學(xué)和基于利尿藥藥理學(xué)研究的快速進(jìn)展，使開發(fā)基于新作用機(jī)制的利尿藥物成為可能。腺苷受體（Adenosine Receptor,AR）阻斷劑已經(jīng)成為研制抗心力衰竭的利尿藥物的新方向。 腺苷受體阻斷劑用于治療心力衰竭的優(yōu)勢主要表現(xiàn)為此類藥物通過阻斷腺苷A_1受體（A_1Adenosine Receptor, A_1R）發(fā)揮利尿作用，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)腎血管舒縮功能，改善腎血流灌注從而保護(hù)腎臟功能。腺苷激活腺苷A_1受體導(dǎo)致腎小球入球小動脈收縮，從而降低腎小球?yàn)V過率；同時(shí)，腺苷還可刺激腎小球旁器的腎素促進(jìn)血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生，加重入球小動脈收縮，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率的進(jìn)一步下降。在動物以及人體試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)阻斷腎臟中腺苷A_1受體不會影響腎小管功能，并可通過改善腎小球血流量和阻斷腎小管球間反饋（tubuloglomerular feedback,TGF）從而改善腎小球?yàn)V過功能。因此，腺苷受體阻斷劑不僅具有維持電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)同時(shí)發(fā)揮排鈉排水的利尿作用，更能夠通過調(diào)節(jié)腎臟血管舒縮狀態(tài)，改善腎臟血流灌注，從而提高腎小球?yàn)V過率，進(jìn)而保護(hù)腎臟功能。 腺苷受體阻斷劑依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同進(jìn)行劃分，包括黃嘌呤類和非黃嘌呤類兩大類。目前的腺苷受體阻斷劑以黃嘌呤類居多。黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑由于其母核結(jié)構(gòu)單一，對分子結(jié)構(gòu)多樣性的變化有較大的限制，導(dǎo)致在藥代動力學(xué)性質(zhì)優(yōu)化、高親和力和高選擇性化合物的化學(xué)合成篩選方面存在明顯的局限性。而非黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑由于化學(xué)母核結(jié)構(gòu)的多樣性、組織選擇性高的優(yōu)勢，已經(jīng)成為腺苷受體阻斷劑研發(fā)的新趨勢。 鑒于以上研究背景，本課題旨在針對自主研發(fā)的2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物進(jìn)行篩選，獲得高親和力、高選擇性，具有明確利尿腎功能保護(hù)作用且藥代動力學(xué)性質(zhì)較為理想的新型非黃嘌呤類腺苷A_1受體阻斷劑。本研究的主要發(fā)現(xiàn)包括： 一、篩選獲得高親和力、高選擇性新型非黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑 首先，我們建立了穩(wěn)定表達(dá)人源A_1R的CHO-K1細(xì)胞株和穩(wěn)定表達(dá)人源A_2AR的HEK-293細(xì)胞株。在大鼠腦組織和穩(wěn)定表達(dá)腺苷受體的細(xì)胞體系中，采用放射配體受體競爭實(shí)驗(yàn)，在兩個(gè)（10-5、10-7M）濃度下，對30個(gè)2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物進(jìn)行篩選，獲得8個(gè)對A_1R具有高親和力的化合物。在此基礎(chǔ)上，用定量藥理學(xué)的方法獲得了這8個(gè)化合物和標(biāo)記配體競爭性與A_1R結(jié)合的Ki值。PQ-69（0.955nM）、 PQ-81（46.5nM）、PQ-83（0.90nM）、PQ-85（1.57nM）、PQ-86（7.07nM）、PQ-88（55.8nM）、PQ-103（1.54nM）、PQ-107（1.07nM）；它們對A_2AR的Ki值分別為：PQ-69（208nM）、PQ-81（67.8nM）、PQ-83（109nM）、PQ-85（52.6nM）、PQ-86（247nM）、PQ-88（1240nM）、PQ-103（154nM）、PQ-107（170nM）。A_1R/A_2AR的選擇倍數(shù)分別為PQ-69（217倍）、PQ-81（1.46倍）、PQ-83（120倍）、PQ-85（33.6倍）、PQ-86（35倍）、PQ-88（22.2倍）、PQ-103（99.9倍）、PQ-107（159倍）。同時(shí)在已建立的表達(dá)多種G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein Coupled Receptors, GPCR）的穩(wěn)定細(xì)胞系上比較了該類化合物對其他GPCR受體的親和力，發(fā)現(xiàn)該類化合物對多巴胺D1、D2、D3受體，膽堿M4、M5受體，腎上腺素α1A、α1B受體的親和力均較低，對A_1R的選擇倍數(shù)都大于1000倍。與文獻(xiàn)報(bào)道的非黃嘌呤類腺苷受體阻斷劑相比，，該類化合物屬于高親和力和高選擇性的化合物，尤其是PQ-69和PQ-83。PQ-69和PQ-83對A_1R的親和力和選擇性與文獻(xiàn)報(bào)道已知的高選擇性A_1R阻斷劑1,3-Dipropyl-8-cyclopentyl xanthine (DPCPX)相當(dāng)或略高。 PQ-69、 PQ-83、DPCPX對A_1R的Ki值分別為：0.955、0.9、1.9nM； A_1R/A_2AR的選擇倍數(shù)為208、109、52.6倍。 其次，通過[35S]-GTPγS（guanosine-5-O-(3-[35S] thio) triphosphate）結(jié)合實(shí)驗(yàn)在G蛋白分子水平上證實(shí)2-(3-氟苯基)-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物本身不能激動A_1R，是A_1R的阻斷劑。此外，我們還發(fā)現(xiàn)PQ-69和PQ-83能夠降低[35S]-GTPγS的基礎(chǔ)結(jié)合量，提示他們具有反向激動A_1R的特點(diǎn)。進(jìn)一步通過檢測G蛋白激活后第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的變化，確證PQ-69和PQ-83兼具A_1R阻斷劑和反向激動劑的特性。 此外，我們還在豚鼠離體氣管條上評價(jià)了PQ-69和PQ-83阻斷A_1R激動劑的作用強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PQ-69和PQ-83可以濃度依賴性地顯著抑制A_1R激動劑2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine (CCPA)收縮氣管條的作用，拮抗CCPA的作用強(qiáng)，拮抗活性與選擇性A_1R阻斷劑DPCPX相當(dāng)。 PQ-69、PQ-83和DPCPX的pA_2值分別為8.99、9.54、8.11；SchildSlope值分別為1.3、1.1、1.2。而且，PQ-69（10-10-10-6M）自身能濃度依賴性地舒張靜息狀態(tài)的離體氣管條，拮抗內(nèi)源性腺苷對氣管條的收縮作用。因此，PQ-69和PQ-83在離體組織水平表現(xiàn)出競爭性A_1R阻斷劑的特點(diǎn)。 二、PQ-69和PQ-83早期藥代動力學(xué)研究 通過計(jì)算機(jī)預(yù)測藥代動力學(xué)性質(zhì)，表明2（-3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物的溶解性質(zhì)、吸收性質(zhì)良好。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步對PQ-69、PQ-83及選擇性A_1R阻斷劑DPCPX的藥代動力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。在大鼠上，靜脈（intravenous, i.v.）和灌胃（per os, p.o.）給予PQ-69，其半衰期明顯長于PQ-83和DPCPX，靜脈半衰期分別為7.92、3.71、2.36小時(shí)；灌胃半衰期分別為9.69、3.16、5.85小時(shí)；在大鼠和人肝微粒體模型中，PQ-69和PQ-83孵育60min后剩余量均大于70%，與陽性化合物DPCPX相比，代謝緩慢，性質(zhì)穩(wěn)定；在Caco-2細(xì)胞模型上，PQ-69的透膜性質(zhì)優(yōu)于PQ-83。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PQ-69的藥代動力學(xué)性質(zhì)明顯優(yōu)于DPCPX。 三、PQ-69早期急性毒性研究 對PQ-69進(jìn)行初步的早期毒性研究，5只雄性小鼠灌胃給予PQ-69（840mg/kg），未出現(xiàn)死亡，14天后未表現(xiàn)任何不良反應(yīng)；7只小鼠灌胃給予PQ-69（2100mg/kg），其中3只雄性鼠，4只雌性鼠均未發(fā)生死亡，14天后未表現(xiàn)任何不良反應(yīng)。 四、PQ-69在正常大鼠及順鉑所致急性腎功能衰竭大鼠利尿及腎功能保護(hù)作用 1、PQ-69（30mg/kg, p.o.）能夠顯著增加正常大鼠尿量（P㩳0.001）；PQ-69（10mg/kg, p.o.）能夠顯著增加大鼠鈉離子排泄（P㩳0.05）。PQ-69（0.03、0.3、1、3mg/kg, i.v.）能夠劑量依賴地顯著增加大鼠尿量，PQ-69（0.3mg/kg, i.v.）與氫氯噻嗪（Hydrochlorothiazide, HCTZ）（1mg/kg, i.v.）及DPCPX（1mg/kg, i.v.）增加尿量相當(dāng)，均能明顯增加大鼠尿量；PQ-69（0.03、0.3、1、3mg/kg, i.v.）劑量依賴性的顯著增加鈉離子、氯離子排泄，與高效利尿劑呋塞米（Furosemide，F(xiàn)URO）（6mg/kg, i.v.）、中效利尿劑氫氯噻嗪（1mg/kg, i.v.）既顯著增加鈉離子、氯離子排泄，同時(shí)又顯著增加鉀離子排泄相比，PQ-69靜脈給藥對鉀離子排泄影響較小，提示PQ-69在發(fā)揮利尿，增加鈉離子、氯離子排泄作用的同時(shí)能夠較少影響鉀離子排泄，維持電解質(zhì)的平衡。 2、在順鉑（5mg/kg, i.v.）致急性腎功能衰竭大鼠模型上，PQ-69（10、30mg/kg,p.o.）與模型組相比呈現(xiàn)增加大鼠尿量趨勢。與高效利尿劑FURO（30mg/kg, p.o.）、中效利尿劑HCTZ（3mg/kg, p.o.）不能改善順鉑造成的大鼠肌酐清除率顯著降低不同，PQ-69（3、10、30mg/kg, p.o.）能夠恢復(fù)大鼠肌酐清除率至正常水平，提示PQ-69具有利尿和腎功能保護(hù)作用。 3、在順鉑（4mg/kg, i.v.）致急性腎功能衰竭大鼠模型上，PQ-69（0.01、0.1、1mg/kg, i.v.）與DPCPX（0.1、1mg/kg, i.v.）均能劑量依賴地顯著增加大鼠尿量和鈉離子、氯離子排泄（P㩳0.05）。與高效利尿劑FURO（6mg/kg, i.v.）顯著增加鉀離子排泄相比，DPCPX（1mg/kg, i.v.）和PQ-69（0.01、0.1、1mg/kg, i.v.）對鉀離子排泄都沒有影響。此外，高效利尿劑FURO（6mg/kg, i.v.）、中效利尿劑HCTZ（1mg/kg, i.v.）對模型大鼠肌酐清除率顯著降低沒有明顯改善作用，而PQ-69（0.1mg/kg, P㩳0.05）、DPCPX（0.1mg/kg, P㩳0.05）與模型組相比，能顯著增加大鼠肌酐清除率，提示PQ-69在發(fā)揮利尿、增加鈉離子、氯離子排泄作用的同時(shí)能夠不影響鉀離子排泄，維持電解質(zhì)平衡，增加肌酐清除率，具有腎功能保護(hù)作用。 4、通過對腎臟病理形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)順鉑（4mg/kg, i.v.）導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)病理損傷，腎皮質(zhì)明顯變薄，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，偶見遠(yuǎn)曲小管蛋白管形，但腎髓質(zhì)中腎小球結(jié)構(gòu)基本正常。PQ-69（0.1mg/kg, i.v.）與DPCPX（0.1mg/kg,i.v.）相比，能夠改善模型組大鼠腎臟皮質(zhì)變薄、近曲小管上皮細(xì)胞腫脹等病理損傷。通過實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測腎臟A_1R和A_2AR的mRNA表達(dá)水平，順鉑（4mg/kg, i.v.）能顯著增加大鼠A_1R（P㩳0.001）和A_2AR（P㩳0.05）mRNA的表達(dá)。通過蛋白免疫印跡法檢測腎臟A_1R、A_2AR的表達(dá)，順鉑（4mg/kg, i.v.）造成大鼠腎臟A_1R、A_2AR蛋白含量表達(dá)有增加的趨勢，提示PQ-69抗順鉑所致腎功能損傷作用可能是通過阻斷或部分阻斷A_1R的表達(dá)上調(diào)實(shí)現(xiàn)。 綜上所述，本研究通過篩選獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高親和力、高選擇性的2-（3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮結(jié)構(gòu)的A_1R阻斷劑，其中PQ-69對A_1R親和力和選擇性較高。通過進(jìn)行體外、離體及體內(nèi)的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)PQ-69兼具A_1R阻斷劑及反向激動劑的特點(diǎn)；在離體水平對A_1R激動劑的拮抗作用強(qiáng)；PQ-69的藥代動力學(xué)性質(zhì)良好，半衰期長，穩(wěn)定性好。在正常大鼠和順鉑所致急性腎功能衰竭大鼠模型上，靜脈給予PQ-69具有較強(qiáng)的利尿、維持電解質(zhì)平衡、保護(hù)腎功能的作用。PQ-69抗順鉑所致急性腎功能衰竭作用可能是通過阻斷或部分阻斷表達(dá)上調(diào)的A_1R實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R96

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1803166