本文選題：磷酸化　切入點：Bcl-2家族蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)　出處：《大連理工大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：Bcl-2家族蛋白是內(nèi)源凋亡通路“開關(guān)”,其成員之間通過BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI),組成一個具有多時空層次、冗余性、連通性和代償性的分子網(wǎng)絡(luò),調(diào)控細胞的生死平衡。研究表明,多個Bcl-2家族成員都會受到上游蛋白激酶通路的精確調(diào)控,進而發(fā)生磷酸化修飾并改變其凋亡調(diào)節(jié)功能。盡管目前Bcl-2家族成員的磷酸化位點已經(jīng)基本闡明,但Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)磷酸化修飾后的新特征還沒有揭示,并且磷酸化修飾調(diào)控這一分子網(wǎng)絡(luò)的作用機制也缺乏有說服力的結(jié)論。 S1是由本課題組研發(fā)的、具有自主知識產(chǎn)權(quán)的小分子BH3模擬物。它的特異性高于同類分子Gossypol,與臨床試驗期的ABT-737相當,僅通過靶向Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)誘導細胞凋亡。而且S1能夠同時拮抗Bcl-2和Mcl-1這兩個關(guān)鍵的抗凋亡Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)節(jié)點蛋白,而ABT-737不能拮抗Mcl-1蛋白。本文以S1作為分子工具,平行對比ABT-737和Gossypol,通過誘導抗性、免疫印跡、免疫共沉淀、外源轉(zhuǎn)染、基因沉默、定量PCR、等溫滴定量熱(ITC)等多種方法,在Bcl-2家族蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中研究了磷酸化修飾后Bcl-2和Mcl-1蛋白抗凋亡功能的改變,明確了參與其磷酸化修飾的信號通路,揭示了磷酸化修飾后Bcl-2家族蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的新特征以及新的網(wǎng)絡(luò)平衡動態(tài)調(diào)控機制。 以S1和ABT-737為工具的研究,在小細胞肺癌(SCLC)細胞內(nèi)揭示了一條Bcl-2表達上調(diào)繼而發(fā)生高度磷酸化(S70)的信號通路：S1等BH3模擬物的凋亡誘導刺激→內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激→MEK/ERK通路激活→CREB/STAT3活化→Bcl-2轉(zhuǎn)錄上調(diào)；MEK/ERK通路激活→Bcl-2高度磷酸化→正反饋激活ERK1/2。這一結(jié)果在分子水平上揭示了小細胞肺癌中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的MEK/ERK通路與Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)之間的串話機制(crosstalk)。Bcl-2蛋白在S70位點的磷酸化修飾能夠增強自身的抗凋亡功能,因此在調(diào)控Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)動態(tài)平衡中扮演關(guān)鍵角色：磷酸化Bcl-2(S70)(pBcl-2(S70))不僅通過結(jié)合更多促凋亡蛋白,重塑Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò),而且能夠通過正反饋激活ERK1/2,進一步放大抗凋亡信號,最終導致小細胞肺癌細胞產(chǎn)生對BH3模擬物的原發(fā)性和獲得性抗性。 在白血病細胞系和白血病患者外周血或骨髓的原代腫瘤細胞中,以S1為工具的研究進一步明確了Bcl-2蛋白通過磷酸化修飾增強了自身的抗凋亡功能。雖然Bcl-2與Bak的相互作用鮮有報道,但本文卻發(fā)現(xiàn)了pBcl-2(S70)能與Bak形成新的相互作用。研究表明,pBcl-2(S70)/Bak是Bcl-2磷酸化修飾(S70)后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)平衡的關(guān)鍵二聚體。這對二聚體的出現(xiàn)重塑了Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)的特征：在S1的刺激下,Bak等促凋亡蛋白能夠在Mcl-1和pBcl-2(S70)這些網(wǎng)絡(luò)節(jié)點之間發(fā)生穿梭,而pBcl-2(S70)是S1所不能拮抗的的關(guān)鍵節(jié)點。這一新的作用模式明確了pBcl-2(S70)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)動態(tài)平衡的分子機制。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析顯示,pBcl-2(S70)/(Bcl-2+Mcl-1)是預(yù)測S1在白血病細胞中敏感性的一個綜合指標。這一指標的發(fā)現(xiàn)從另一個角度反映出pBcl-2(S70)是在Bcl-2家族網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮抗凋亡功能的,Bcl-2蛋白的磷酸化(S70)增強了網(wǎng)絡(luò)的抗凋亡能力。 利用S1對比ABT-737和Gossypol,在黑色素瘤細胞中的研究揭示了Mcl-1通過磷酸化修飾(T163)增強了自身的抗凋亡功能,進而對抗BH3模擬物的凋亡誘導作用。證明MEK/ERK和JNK通路共同介導了黑色素瘤細胞中Mcl-1的磷酸化(T163). pMcl-1(T163)通過重新捕獲被BH3模擬分子從Bcl-2上釋放的促凋亡蛋白,表現(xiàn)出“替補”的抗凋亡作用,維持了網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)健性。因此,pMcl-1(T163)是黑色素瘤一個新的治療靶點。經(jīng)過基于細胞的篩選,結(jié)合ITC試驗,獲得一個能夠直接結(jié)合pMcl-1(T163)的BH3模擬物-Compound6。研究表明,Compound6能誘導Mcl-1降解,并且不依賴Noxa單劑誘導黑色素瘤細胞凋亡。
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【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：O629.73

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 陳了;;陳了素描作品[J];設(shè)計;2014年07期

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本文編號：1594497