本文選題：低氧　切入點：K562細胞　出處：《浙江大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：低氧是實體瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在的環(huán)境條件之一,是腫瘤發(fā)生惡性轉化甚至轉移的啟動因子。同時,缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)與腫瘤的生長和發(fā)展密切相關,是近年來國內外抗腫瘤研究的一個重要的治療靶點。3-(4-溴苯基)-2-(乙砜基)-6-甲基喹喔啉-1,4-二氧化物(Q39)是由替拉扎明(tirapazamine,TPZ)結構修飾得到的具有自主知識產權的全新化合物,可在低氧條件下誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡,因此對其低氧抗腫瘤作用進行研究,將有助于了解Q39乃至TPZ類似物發(fā)揮低氧誘導腫瘤凋亡的機制,為相關低氧抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)提供科學依據。本研究探索了Q39在低氧條件下誘導人白血病K562細胞和人肝癌Bel-7402細胞凋亡的作用機制。 方法：1)MTT法測定Q39對人白血病K562細胞和肝癌Bel-7402細胞的增殖抑制作用,計算其半數抑制濃度(IC5o)。2)采用DAPI染色法觀察K562細胞的凋亡情況。3)采用PI染色結合流式細胞術測定K562細胞和Bel-7402細胞的凋亡率。4)JC-1染色法觀察Q39對K562細胞線粒體膜電位(△Ψm)的影響。5)采用Western blotting法檢測低氧條件下細胞內procaspase-3、cleaved caspase-3、PARP、 Bax、Bcl-2、p-ERK、p-JNK、p-p38、VEGF和HIF-1α等蛋白表達的變化。6)采用免疫熒光法觀察HIF-1α經Q39作用后的入核情況。 結果： 一、Q39在低氧條件下誘導人白血病K562細胞的凋亡的作用機制研究：1)Q39在低氧條件(3%O2)下能夠明顯抑制人白血病K562細胞的增殖,其IC50為(0.21±0.05)μmol/L。2)經DAPI染色證實,Q39作用6h后開始誘導K562細胞發(fā)生凋亡,后期細胞體積縮小,并出現(xiàn)凋亡小體。3)流式細胞術結果顯示：20%02環(huán)境中K562細胞與Q39共孵育0、12、24和48h的凋亡率分別為5.5%、5.1%、4.6%和24.4%,而3%02環(huán)境中相應的誘導凋亡率分別達到了4.1%、34.5%、42.5和60.1%,表現(xiàn)出明顯的時效依賴性及低氧選擇性。4)JC-1染色實驗結果顯示：孵育0、6、12、24和48h后Q39使K562細胞的△中m呈明顯下降趨勢,并且具有時效依賴關系,提示Q39誘導K562的凋亡可能是通過線粒體信號轉導通路實現(xiàn)。5) Western-blotting結果顯示：Q39在低氧條件下降低K562細胞的HIF-1α、VEGF、procaspase-3和Bcl-2蛋白表達,顯著增加Bax和cleaved caspase-3蛋白表達,并且促使PARP裂解。Q39顯著下調了p-ERK和p-p38的表達水平,同時增加了p-JNK的表達,兩者的調節(jié)具有時效依賴性。 二、Q39在低氧條件下誘導人肝癌Bel-7402細胞凋亡的作用機制研究：1)Q39在低氧條件下抑制人肝癌Bel-7402細胞增殖,其ICso為(3.87±0.56) μmol/L。2)Q39在低氧條件下誘導Bel-7402細胞凋亡,5、10、20μmol/L的Q39引起的凋亡率分別為(27.1±4.8)%、(50.2±5.6)%和(62.5±6.2)%,其誘導凋亡作用呈濃度依賴性增加。3)隨著低氧作用時間的延長,ERKl/2,JN和p38總蛋白水平變化不明顯；而各自的磷酸化水平卻呈現(xiàn)良好的時效依賴性,說明低氧條件激活MAPK通路表達。4)Q39在低氧條件下抑制人肝癌細胞Bel-7402的ERK1/2的磷酸化,但并不影響p38和JNK的磷酸化,說明Q39在低氧條件下發(fā)揮抗腫瘤活性時可能主要影響ERKl/2的活性。5)免疫熒光法證實在3%氧壓環(huán)境下Q39作用16小時后能明顯阻斷低氧誘導的HIF-1α入核過程,影響其細胞核內外分布,減少具備活性的形成HIF-1α;同時Western blot法檢測Q39(0-20μmol/L)作用后HIF-1α蛋白表達,結果發(fā)現(xiàn)Q39明顯降低低氧激活的HIF-1α蛋白表達,說明Q39可能通過抑制ERK1/2磷酸化影響HIF-1α的轉位,最終導致HIF-1α蛋白表達水平降低,從而引起細胞的凋亡。 結論：Q39在低氧條件下對K562細胞和Bel-7402細胞具有較好的抑制作用,并能通過降低HIF-1α蛋白表達和調節(jié)其他凋亡相關蛋白表達誘導細胞凋亡。Q39誘導K562細胞凋亡可能是通過激活依賴于caspase級聯(lián)反應的線粒體通路和低氧相關的HIF-1信號傳導通路實現(xiàn)的。Q39誘導Bel-7402細胞凋亡可能通過調控ERKl/2信號通路,阻斷HIF-1α入核過程,促進HIF-1α蛋白降解,減少HIF-1α蛋白合成。上述實驗結果將有利于我們發(fā)現(xiàn)低氧條件下新的抗腫瘤藥物作用靶點,對阻斷和抑制HIF-1α介導的低氧腫瘤生長和惡性化提供新的思路。
[Abstract]:Objective: hypoxia is one of the process of tumor occurrence and development of environmental conditions, is the malignant transformation of tumor metastasis and promoter. At the same time, hypoxia inducible factor (Hypoxia-inducible, factor, HIF) is closely associated with tumor growth and development, is an important therapeutic target of.3- in recent years at home and abroad of anti-tumor research (4- Bromophenyl) -2- (ethyl sulfone) -6- methyl quinoxaline -1,4- dioxide (Q39) is composed of tirapazamine (tirapazamine, TPZ) modified structure obtained with independent intellectual property rights of the new compounds can induce tumor cell apoptosis under hypoxic conditions, so the research on the anti-tumor effect of hypoxia, will help to understand Q39 and TPZ analogues play mechanism of hypoxia induced apoptosis of the tumor cells, and provide a scientific basis for the research and development related to hypoxia antitumor drugs. This study explored Q39 in hypoxia induced The mechanism of apoptosis of human leukemia K562 cells and human hepatocellular carcinoma Bel-7402 cells.
Methods: 1) the determination of inhibitory effect of Q39 on human leukemia cells K562 and human hepatoma Bel-7402 cells proliferation by MTT method, to calculate the half inhibitory concentration (IC5o).2) was observed by DAPI staining and the apoptosis of K562 cells.3) using PI staining combined with K562 cells and Bel-7402 cells apoptosis were measured by flow cytometry. The rate of.4 JC-1) staining method to observe the effect of Q39 on mitochondrial membrane potential of K562 cells (lpli m) the effect of.5 procaspase-3 cells in hypoxic conditions) were detected by Western blotting cleaved Caspase-3, PARP, Bax, Bcl-2, p-ERK, p-JNK, p-p38, VEGF and HIF-1 expression of.6 alpha protein) immunofluorescence was used to observe HIF-1 alpha after the action of Q39 into the nucleus.
Result錛，

本文編號：1565187